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本产品采用C81细胞内钙离子荧光探针检测钙离子浓度水平变化。钙离子浓度变化是活细胞接受外界刺激后产生级联反应的重要信息传递方式，因此细胞内钙离子检测是信号转导G蛋白偶联受体(GPCR)介导的相关药物筛选以及其他相关实验中非常重要的一种研究手段。
C81钙离子探针经过特殊设计，疏水性很强，消除了电荷，容易通过细胞膜，具有极高的细胞渗透性，经过简单孵育即可实现细胞加载。穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成不易透过细胞膜的C81新产物，从而被滞留在细胞内。细胞内的C81钙离子探针能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。
C81游离配体几乎是非荧光性的，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。但是，当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，荧光会增加60至100倍，避免了自发荧光的干扰，因而可以直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为515～530nm。可以使用荧光显微镜、酶标仪、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。
C81探针采用可见光激发，与传统的Fura-2等紫外光激发的荧光探针相比，可避免紫外光对细胞的损伤，仪器的适用范围更广泛，具有更强的探针吸收性能，使得更低浓度的探针即可成功检测Ca2+变化，从而降低了对活细胞的光毒性，检测敏感度更高。C81与Ca2+亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+的快速、微量变化。
检测方法：
● 流式细胞仪● 荧光显微镜● 激光共聚焦
样本类型：
● 悬浮细胞● 贴壁细胞
试剂盒以外自备试剂和仪器
● 荧光酶标仪/分光光度计/激光共聚焦/流式细胞仪/荧光显微镜等● PBS/HBSS(无酚红)

组份	50T	100T
组份A：C81钙离子探针	50μL	50μL×2
组份B：通透剂B	5mL	10mL
组份C：淬灭剂C	5mL	10mL

短期2～8℃保存，长期-20℃避光保存，避免反复冻融，可以根据需要小量分装保存。有效期6个月。
注：
● 染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
● 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。


● 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
● 探针为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
● 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
● 细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。
● 染色后立即进行分析。
● C81探针容易受潮，稳定性较差，注意干燥保存。从冰箱取出后，请确认在干燥的环境放至室温后再开封。
● C81探针母液时要用干燥的新吸头，不能使用含水的吸头。
● 未使用完的C81探针母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。母液遇水极易分解，如果长期不用，建议根据每次使用量分装保存，用封口膜封口，并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在≤-20℃密封避光保存。
● C81探针工作液含水，配制后不可以长期保存，须现配现用。
● C81融解后离心至管底部再打开螺旋盖，防止开盖时损失。
● 可以在染色工作溶液中加入20% Pluronic F127溶液(可选步骤),Pluronic F127可以帮助C81更快进入细胞，不建议在Pluronic F127中长期保存C81溶液。
● 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先确定最佳条件。在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件.
使用方法：(以下方法仅供参考)

• 染色工作液的配制：
  用HBSS稀释C81溶液200倍～500倍，配制成C81染色工作液。
  注：
  ● 推荐该探针加载终浓度在200～500倍稀释，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。200倍稀释时候大部分细胞样本。
  ● 为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。
  ● 工作液需现配现用，避免反复冻存。
  ● 不能用含血清的培养基稀释探针。可以用相应的无血清培养基稀释探针。
  
• 收集培养好的待测细胞样本，用HBSS洗涤细胞3次。
  注：
  ● 没有HBSS也可以用PBS洗细胞。
  ● 培养基血清中的酯酶会降解C81探针，从而降低C81进入细胞的效果。所以加工作液之前必须充分洗涤细胞，尽量去除培养基残留。
  ● 可以收集细胞后染色，也可以原位染色。
  
• 离心去上清后，将C81染色工作液加入细胞，在37℃孵育30～60分钟。
  注：
  ● 关于孵育的时间，首次预实验不能确定，建议先孵育30分钟。
  ● 根据荧光效果：如果太强，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。
  ● 染色工作液加入量以覆盖细胞即可。
  ● 如果C81探针进入细胞的效果不好，可向C81染色溶液中加入适量20% Pluronic F127溶液，最终稀释至其终浓度为0.04～0.05%,Pluronic F127可以防止C81在HBSS中聚合并能帮助其进入细胞。
  ● Pluronic F127可降低C81探针的稳定性，因此只能在配制工作液时加入，不能将其加入储存液长期保存。
  
• 用HBSS洗涤细胞2～3次。
  
• 用200μL或500μL HBSS重悬细胞。在37℃下再继续孵育20～40分钟。
  注：
  ● 根据下游检测仪器选试剂量，一般激光共聚焦/酶标仪/分光光度计用200μL体系，流式用500μL体系。
  
• 然后用该细胞进行荧光钙离子检测。激发波长488～495nm，发射波长516nm。得到荧光值F。
  
• 在细胞重悬液中加入10%体积的(20μL或50μL)通透剂，充分混匀，在37℃避光孵育10分钟。测定荧光值F1。
  
• 在以上细胞重悬液中加入10%体积的(20μL或50μL)淬灭剂，充分混匀，在37℃避光孵育10分钟。测定荧光值F0。
  注：
  ● 以上F、F1、F0测定时必须使用同一台仪器。
  
• 根据以下公式计算钙离子浓度：
  钙离子浓度= 346nM×(F-F0)/(F1-F)

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