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NadRed Plus是一种溴化乙锭(EB)的升级换代产品，用于凝胶中DNA、RNA等核酸的染色。NadRed Plus和NadRed红色核酸染料、Redye红色核酸染料一样具有安全(致突变性极低且检测不到显著的细胞毒性)、灵敏度高、稳定性好等优点，凝胶中的核酸在使用本制品染色后用适当紫外灯(300nm左右波长)检测呈现红色荧光，适用于原先使用EB为染料的凝胶成像系统。NadRed Plus相对于NadRed和Redye使用方法完全一致，但可获得更好的条带分离效果。

通过凝胶回收试剂盒或酚氯仿抽提，可以有效去除与DNA或RNA结合的NadRed Plus，从而确保不会影响后续的连接、酶切、PCR、测序等常规的分子生物学用途。

• NadRed Plus可大大降低条带的拖尾和弯曲，条带更清晰、更均匀、背景更低。Redye和NadRed可能存在一定程度的条带拖尾、弯曲、背景高等现象，NadRed Plus基本解决了这些问题，而且分子量大的条带也可得到较为完美的分离效果。
  
• NadRed Plus比EB和SYBR Green更安全。NadRed Plus在远高于其工作浓度范围时均没有细胞毒性及诱变性。艾姆斯氏试验(Ames test)结果表明，NadRed Plus的诱变性远小于EB。EB在多种致突变测试中呈现很强的诱变性，而NadRed Plus仅仅在浓度高达20μg/mL时，并在S9代谢活化时有非常微弱的诱变性。NadRed Plus和百奥莱博另外几种安全型核酸染料NadRed、NadGreen、NadGreen Plus、BalbAIE NadGreen，由于它们特殊的化学结构使其难以进入细胞，从而大大降低甚至避免了染料的致突变性和细胞毒性。而SYBR Green染料可以穿透细胞膜，进入活细胞并染色DNA，并且有报道SYBR Green可以强烈增强紫外线诱导的基因突变。
  
• NadRed Plus检测灵敏度高，对于小分子量核酸的染色效果好。NadRed Plus的检测灵敏度比EB高8～10倍，在检测低浓度、微量DNA或RNA方面比EB更佳，尤其对小分子量的DNA检测非常灵敏。在使用浸泡染色法时，NadRed Plus和SYBR Gold的灵敏度相近甚至更高；与SYBR Gold不同的是，NadRed Plus预先配制在凝胶中也有很高的灵敏度。EB对于小分子量核酸的染色效果差，而NadRed对于小分子量核酸的染色效果很好，便于观察酶切或PCR获得的小分子量核酸片段。推荐使用的NadRed Plus浓度，其检测效果略优于EB。
  
• NadRed Plus的稳定性好，染色重复性高。含SYBR Green的凝胶核酸染色的重复性比较差，通常是由于SYBR系列染料的稳定性差导致的。而NadRed的稳定性很好，可以室温长时间保存及使用微波炉加热。NadRed Plus的光稳定性良好，可以在室内正常光线下操作而无需避光。由于其热稳定性和光稳定性，含NadRed Plus的凝胶在核酸染色时的重复性非常好。
  
• NadRed Plus可以使用和EB相同的检测体系。NadRed Plus和EB的激发光和发射光都非常接近，可以直接用NadRed Plus替换EB，而不必更换已有的凝胶观察、拍照或成像系统(约300nm激发)。
  
• NadRed Plus的使用方法和EB一致。NadRed Plus可以按适当比例直接加入琼脂糖中配制成凝胶，也可以在电泳完毕后对凝胶进行染色。前者更加方便，而后者灵敏度要更高一些。但由于NadRed Plus本身已经非常灵敏，通常采用把NadRed Plus直接配制在凝胶中就可以了。对于一些特殊情况，如核酸样品量特别少的情况等，则可以考虑电泳后再对凝胶进行染色。
  
• NadRed Plus对条带迁移几乎没有影响。使用NadRed Plus时，样品的上样量不影响条带美观，即使上样量很高，也可获得良好的条带分离效果。

• 为确保使用的不是假冒的NadRed Plus，可以用细胞培养液把NadRed Plus稀释至1×，然后对培养的活细胞进行染色。随后在荧光显微镜下尝试用各种激发光观察，如果发现活细胞细胞核出现明显的荧光，则可以判定为假冒产品。如果各种激发光下活细胞均无荧光，则说明该核酸染料是不能进入活细胞的高度安全的染料。具有强致突变性的吖啶橙染色核酸后呈现荧光，但其可以染色活细胞，而NadRed Plus不会染色活细胞。
  
• 制备好的NadRed Plus琼脂糖凝胶，在4℃避光条件下通常可以保存3～5天。
  
• NadRed Plus琼脂糖凝胶再次熔化使用时，为取得更好的观察效果，需要添加适量NadRed Plus。
  
• 电泳之后的凝胶不建议重复使用。
  
• 电泳后再使用NadRed Plus染色的凝胶一般不需要脱色。如果发现背景太高，可以使用不含核酸酶的水进行脱色处理。
  
• NadRed和NadGreen系列产品除了可以染色双链DNA外，也可染色单链DNA和RNA。NadRed Plus对单链核酸的染色灵敏度约为对双链DNA染色灵敏度的一半。NadRed Plus对单链核酸的染色灵敏度约为NadGreen Plus的5倍。
  
• 如果使用聚丙烯酰胺凝胶，请使用浸泡染色法染胶，并延长染色时间至30分钟～1小时。
  
• 如果观察到条带弥散或者分离不理想，建议使用浸泡染色法染色以确认是否与染料有关。如果浸泡染色法染色后仍然出现类似的问题，说明与染料无关，请尝试以下方法：使用新鲜配制的电泳缓冲液、降低核酸的上样量、降低染料的浓度、降低琼脂糖浓度、选用更长的凝胶、降低电泳电压一倍以上并延长凝胶电泳时间以改善电泳效果、使用更薄的梳齿等。
  
• 本制品兼容常用的电泳缓冲液，例如TAE和TBE。
  
• NadRed类产品不属于有毒有害物质，并通过了环境安全相关测试，相关废弃物无需特殊处理，可参考常规化学试剂进行处理。

• 琼脂糖凝胶中添加NadRed Plus：
  根据需要配制适当浓度(例如1～3%)的琼脂糖胶液。在琼脂糖完全融解后，适当冷却但又不会使琼脂糖凝固时，按照每100mL胶液加入50μL NadRed Plus的比例(2000:1)加入NadRed Plus。混匀后即可把琼脂糖胶液倒入制备凝胶的模具中。适量的DNA或RNA在该胶中电泳后，在紫外灯下可以观察到明亮的核酸条带。
  
  NadRed Plus非常稳定，所以NadRed Plus可以像EB一样在琼脂糖凝胶液加热融解后但未凝固前加入并混匀，也可以在琼脂糖融解前加入，然后再微波炉加热融解并混匀。
  
  
• 电泳完毕后对琼脂糖凝胶染色：
  按照每100mL 100mM NaCl溶液或水中加入100～200μL NadRed Plus的比例(500-1000:1)加入NadRed Plus，配制成NadRed Plus染色液。把电泳完毕的琼脂糖凝胶放到适当的容器中，加入适量上述配制好的NadRed Plus染色液，确保至少盖住凝胶。在摇床上缓慢摇动(约30～50rpm)染色20～30分钟。染色时间根据胶的厚度而定，胶厚则染色时间需要长一些，胶薄则染色时间可以短一些。染色完毕后，在紫外灯下即可观察核酸条带。要观察到更为清晰的条带，可以在染色后用水漂洗1～2次，每次3～5分钟，以消除背景，然后在适当紫外灯下或用凝胶成像系统观察。
  • NadRed Plus染色液可以重复使用3次左右。
    
  • NadRed Plus染色液也可以一次大量制备，在室温下避光保存，直至用完。
    
  • 对于核酸需要回收的情况，操作过程中需要注意避免核酸酶污染。

• NadRed Plus的琼脂糖凝胶电泳图参考图1。
  
  
  
  图1.NadRed Plus用于DNA marker琼脂糖凝胶电泳的效果图。泳道1-3分别为DNA Ladder(100bp～10kb)上样5μL、3μL、1μL的电泳检测效果；泳道4-6分别为DNA Ladder(200bp～12kb)上样5μL、3μL、1μL的电泳检测效果。实际检测效果会因核酸样品种类和大小、电泳槽、核酸染料、电泳条件等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
  
• 本制品用于活细胞染色的效果图参考图2。
  
  
  
  图2.NadRed Plus对HeLa活细胞染色效果图。图A为HeLa细胞在明场下的形态图；图B为NadRed Plus染色效果图。可见，NadRed Plus几乎无法进入活细胞，细胞毒性极低。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。