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本制品由不同长度的单链DNA分子混合而成，7条带的大小为20、25、30、35、40、50、75nt。该产品不含有上样缓冲液，可以根据实验需求使用不同的上样缓冲液，用于尿素变性电泳或非变性电泳。本制品附带2×TBE尿素上样缓冲液和2×非变性PAGE DNA上样缓冲液，方便待检样品的上样。

• 即用型单链DNA Ladder(20～75nt)配制方法：
  
  • 进行尿素变性电泳：
    

    即用型单链DNA Ladder(20～75nt)	配制体积20μL
    单链DNA Ladder(20～75nt)	10μL
    2×TBE尿素上样缓冲液	10μL
    混匀，70℃处理5分钟。

    
    
  • 进行非变性电泳：
    

    即用型单链DNA Ladder(20～75nt)	配制体积20μL
    单链DNA Ladder(20～75nt)	10μL
    2×非变性PAGE DNA上样缓冲液	10μL
    混匀，不用加热处理。

• 凝胶制备：
  
  • 以下使用方法均以8×10cm凝胶厚1.0mm示例，其他规格凝胶请适当调整。
  • TBE-尿素凝胶制备：
    
    • 可以选择DNA尿素PAGE电泳试剂盒或按照以下程序制胶：
      表一：TBE-尿素PAGE分离胶配方表(总体积5mL，适用于厚度1.0mm小板胶)
      

      单链DNA长度	最佳凝胶浓度	尿素	40%PAA(29:1)	10×TBE	灭菌水	10%APS	TEMED
      200～1000nt	5%	2.1g	0.625mL	0.5mL	至5mL	50μL	5μL
      50～400nt	8%		1mL
      30～300nt	10%		1.25mL
      10～150nt	15%		1.875mL
      5～120nt	20%		2.5mL

    • 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5cm的水层，使凝胶表面保持平整。
      
    • 静置10～20分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。
      
      • 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
    • 去除覆盖在分离胶上的水层；按照表二将不同体积成分在一个小烧杯中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
      表二：TBE-尿素PAGE 4%浓缩配方表(总体积2mL，适用于1.0mm厚度胶)
      

      凝胶浓度	尿素	40%PAA(29:1)	10×TBE	灭菌水	10%APS	TEMED
      4%	0.84g	0.2mL	0.2mL	至2mL	20μL	2μL

    • 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
      
    • 静置30～60分钟，等待浓缩胶聚合。
      
      • 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
  • 非变性凝胶制备：
    
    • 可以选择非变性PAGE DNA电泳试剂盒或按照以下程序制胶。
      
    • 按照表三将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合；最后加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
      
    • 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5cm的水层，使凝胶表面保持平整。
      
    • 静置10～20分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。
      表三：TBE-非变性PAGE分离胶配方表(总体积5mL，适用于厚度1.0mm小板胶)
      

      最佳DNA分离范围	凝胶浓度	灭菌水	30%PAA(29∶1)	5×TBE	10%APS	TEMED
      70～450bp	6%	3mL	1mL	1mL	50μL	5μL
      60～460bp	8%	2.66mL	1.34mL
      50～300bp	10%	2.33mL	1.67mL
      40～200bp	12%	2mL	2mL
      25～150bp	15%	1.5mL	2.5mL
      5～100bp	20%	0.66mL	3.34mL

      • 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
    • 去除覆盖在分离胶上的水层；按照表四将不同体积成分在一个小烧杯或试管中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
      表四：TBE-非变性PAGE 4%浓缩配方表(总体积1.5mL，适用于1.0mm厚度胶)
      

      凝胶浓度	灭菌水	30%PAA(29∶1)	5×TBE	10%APS	TEMED
      4%	1mL	200μL	300μL	20μL	2μL

    • 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
      
    • 静置30～60分钟，等待浓缩胶聚合。
      
      • 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
• 样品制备：
  根据实验目的，配制即用型单链DNA Marker样品（步骤A）。单链DNA样品使用尿素变性电泳，双链DNA样品使用非变性电泳，单链/双链混合样品使用非变性电泳。
  
• 电泳：
  
  • 预电泳（可选）：电泳槽内外加入适量1×TBE缓冲液稳压200V预电泳30分钟。电泳结束后，用1×TBE缓冲液彻底冲洗加样孔2～3次。
    
  • 上样：根据梳齿确定Marker上样量，一般是10齿1mm厚梳子上样5μL，15齿1mm厚梳子上样3μL。
    
  • 连接电源线，打开电源开关，按照以下条件电泳。
    

    	恒电压	起始电流	结束电流	电泳时间	适用条件
    推荐电压	200V	15～20mA/板胶	10～15mA/板胶	60+ min	最佳电压，最优的分辨率

  • 等待上样缓冲液的溴酚蓝指示前沿到凝胶底部时终止电泳，取出凝胶进行后续实验。
    

    胶浓度	溴酚蓝	二甲苯菁
    5%	~35nt	~130nt
    8%	~19nt	~75nt
    10%	~15nt	~55nt
    15%	~10nt	~52nt
    20%	~8nt	~35nt

• 染色：
  用单链DNA PAGE电泳染色试剂盒(货号：RFT204)，核酸PAGE电泳染色试剂盒(货号：RFT205)或核酸快速染色试剂盒(货号：RFT206)染色均可以得到清晰的条带分离效果。
  
  • 如果使用核酸染料染色，RealGood Red或RealGood All核酸染料结合单链核酸效果最佳，强烈建议使用以便获得最佳效果的胶图。其余染料如GelRed，Goldview，EB等染色效果不好。