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非变性PAGE DNA电泳试剂盒图片
产品货号:
RFT331
中文名称:
非变性PAGE DNA电泳试剂盒
英文名称:
DNA Native-PAGE Electrophoresis Kit
产品规格:
45T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本试剂盒包含凝胶制备及电泳所需的全部试剂,用户只需自备制胶器具和蒸馏水,即可配制各种浓度的PAGE胶,使用方便。


非变性PAGE电泳是研究DNA构象变化的常用手段,在非变性条件下DNA的泳动与电荷、片段大小、DNA结合的蛋白及折叠构象都有关系。非变性PAGE电泳是研究单链PCR片段构象多态性(SSCP-PCR)的重要研究手段。在SSCP测定中,双链DNA(dsDNA)变性为单链DNA(ssDNA),每一条单链DNA都基于他们的内部序列呈现不同的折叠构象,即使相同长度的单链DNA因其碱基顺序不同,甚至单个碱基的不同都会形成不同的构象。这些不同构象的ssDNA在非变性PAGE中得到分离。另外,非变性PAGE还可以分离小片段的双链DNA,与琼脂糖电泳相比,对低于500bp的双链DNA片段有更优秀的分辨率。


组分规格保存
30%PAA(29:1)100mL4℃
5×TBE500mLRT
APS(干粉)5mLRT
TEMED0.5mL4℃,避光
6×Native-PAGE DNA上样缓冲液1mL4℃

保存:按标签指示条件保存,有效期一年。


本试剂盒大约可以配制20-45块常规大小(8×10cm)PAGE凝胶,具体数量根据凝胶厚度决定:0.75mm厚度凝胶可以配制45块胶,1mm厚度凝胶可以配制至少35块胶,1.5mm厚度凝胶可以配制至少20块胶。


10% APS配制-5mL:
将0.5g APS干粉溶于5mL灭菌水中,彻底溶解后分装,1mL/支,-20℃备存,每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间,以防失效。10%APS在4℃有效期为一周,-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长,应考虑更换使用-20度保存的10% APS。


一、制备凝胶
以下步骤为制备8×10cm厚度1.0mm胶
  • 参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。
  • 按照表一将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合;最后加入10%APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。
  • 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液(对于mini-gel,凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可),然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5cm的水层,使凝胶表面保持平整。
  • 静置10~20分钟,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后,说明凝胶已聚合
    表一:TBE-PAGE分离胶配方表(总体积5mL,适用于厚度1.0mm小板胶)
    最佳DNA分离范围凝胶浓度各组份体积(ml)
    灭菌水30%PAA(29∶1)5×TBE10%APSTEMED
    70~450bp6%31.01.00.050.005
    60~460bp8%2.661.341.00.050.005
    50~300bp10%2.331.671.00.050.005
    40~200bp12%22.01.00.050.005
    25~150bp15%1.52.51.00.050.005
    5~100bp20%0.663.341.00.050.005
    注:凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
  • 去除覆盖在分离胶上的水层;按照表二将不同体积成分在一个小烧杯或试管中混合;最后加入10%过硫酸铵和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。
    表二:TBE-PAGE 4%浓缩配方表(总体积1.5mL,适用于1.0mm厚度胶)
    凝胶浓度各组份体积(ml)
    灭菌水30%PAA(29:1)5×TBE10%APSTEMED
    4%1.00.20.30.020.002

  • 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端;将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。
  • 静置30~60分钟,等待浓缩胶聚合。
    注:凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。


二、电泳
  • 1×TBE电泳液配制:取100mL 5×TBE,加蒸馏水400mL,即配成500mL 1×TBE。将凝胶板固定在电泳装置上,往上槽和下槽中加入足够1×TBE电泳液。用1mL吸头冲洗加样孔1~2次。
  • 取待测样品,加入相应体积6×Native PAGE DNA上样液,如5μL样品加1μL上样液,短暂离心后取5~10μL上样。TBE-PAGE中判断双链DNA大小可以选择20bp DNA ladder(20~500bp,货号:RFT312)作为DNA Marker。
  • 连接电源线,打开电源开关。200 V稳压电泳。至二甲苯菁指示前沿到达凝胶三分之二位置时结束电泳。
    TBE-PAGE电泳
    恒电压起始电流结束电流电泳时间
    200 V20-25 mA/板胶10-15 mA/板胶70+min


三、染色
  • 漂洗:玻璃板上拆下凝胶后,适量蒸馏水漂洗3~5分钟。
  • 染色液配制:TBE-PAGE胶可以使用EB或RealGood类染料后染染色,以下程序用RealGood Red核酸染料进行染色。即用型染色液配制:
    100mL即用型RealGood核酸染色液
    1×TBE100mL
    RealGood Red核酸染料20μL

  • 染色:凝胶浸泡于即用型染色液中,常温避光摇床40~60rpm染色30分钟。



  • 为何SSCP-PCR带型有复合条带?
    • 可能是残留的PCR引物跟单链的DNA结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。
    • 可能是PCR产物用量过高,彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4~8倍后使用。
  • 如何提高电泳分辨率?
    可以在配胶时加入甘油(终浓度为5%~10%),因为甘油是弱变性剂,能部分展开DNA折叠结构,增加表面积,增加电泳时位移差异。但加入甘油后粘性变大,电泳速度变慢,因此只适合常温电泳使用,不要4℃电泳。如果条件允许,最好同时做加甘油和不加甘油的电泳实验。



非变性PAGE DNA电泳试剂盒
非变性PAGE DNA电泳试剂盒


DNA在PAGE中的有效分离范围
PAGE浓度DNA有效期分离范围二甲苯菁溴酚蓝二甲苯菁溴酚蓝
%(w/v) C3.3双链bp单链nt 染料迁移率相当于双链DNA片段粗略大小染料迁移率相当于单链DNA片段粗略大小
3.51000-2000750-200046010015045
5.080-500200-10002606513035
8.060-40050-400160457519
12.040-20030-30070205515
15.025-15010-15060155210
20.06-1008-1204512508

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