产品货号:
RFT331
中文名称:
非变性PAGE DNA电泳试剂盒
英文名称:
DNA Native-PAGE Electrophoresis Kit
产品规格:
45T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒包含凝胶制备及电泳所需的全部试剂,用户只需自备制胶器具和蒸馏水,即可配制各种浓度的PAGE胶,使用方便。
非变性PAGE电泳是研究DNA构象变化的常用手段,在非变性条件下DNA的泳动与电荷、片段大小、DNA结合的蛋白及折叠构象都有关系。非变性PAGE电泳是研究单链PCR片段构象多态性(SSCP-PCR)的重要研究手段。在SSCP测定中,双链DNA(dsDNA)变性为单链DNA(ssDNA),每一条单链DNA都基于他们的内部序列呈现不同的折叠构象,即使相同长度的单链DNA因其碱基顺序不同,甚至单个碱基的不同都会形成不同的构象。这些不同构象的ssDNA在非变性PAGE中得到分离。另外,非变性PAGE还可以分离小片段的双链DNA,与琼脂糖电泳相比,对低于500bp的双链DNA片段有更优秀的分辨率。
保存:按标签指示条件保存,有效期一年。
本试剂盒大约可以配制20-45块常规大小(8×10cm)PAGE凝胶,具体数量根据凝胶厚度决定:0.75mm厚度凝胶可以配制45块胶,1mm厚度凝胶可以配制至少35块胶,1.5mm厚度凝胶可以配制至少20块胶。
10% APS配制-5mL:
将0.5g APS干粉溶于5mL灭菌水中,彻底溶解后分装,1mL/支,-20℃备存,每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间,以防失效。10%APS在4℃有效期为一周,-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长,应考虑更换使用-20度保存的10% APS。
一、制备凝胶
以下步骤为制备8×10cm厚度1.0mm胶
二、电泳
三、染色
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非变性PAGE电泳是研究DNA构象变化的常用手段,在非变性条件下DNA的泳动与电荷、片段大小、DNA结合的蛋白及折叠构象都有关系。非变性PAGE电泳是研究单链PCR片段构象多态性(SSCP-PCR)的重要研究手段。在SSCP测定中,双链DNA(dsDNA)变性为单链DNA(ssDNA),每一条单链DNA都基于他们的内部序列呈现不同的折叠构象,即使相同长度的单链DNA因其碱基顺序不同,甚至单个碱基的不同都会形成不同的构象。这些不同构象的ssDNA在非变性PAGE中得到分离。另外,非变性PAGE还可以分离小片段的双链DNA,与琼脂糖电泳相比,对低于500bp的双链DNA片段有更优秀的分辨率。
组分 | 规格 | 保存 |
30%PAA(29:1) | 100mL | 4℃ |
5×TBE | 500mL | RT |
APS(干粉) | 5mL | RT |
TEMED | 0.5mL | 4℃,避光 |
6×Native-PAGE DNA上样缓冲液 | 1mL | 4℃ |
保存:按标签指示条件保存,有效期一年。
本试剂盒大约可以配制20-45块常规大小(8×10cm)PAGE凝胶,具体数量根据凝胶厚度决定:0.75mm厚度凝胶可以配制45块胶,1mm厚度凝胶可以配制至少35块胶,1.5mm厚度凝胶可以配制至少20块胶。
10% APS配制-5mL:
将0.5g APS干粉溶于5mL灭菌水中,彻底溶解后分装,1mL/支,-20℃备存,每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间,以防失效。10%APS在4℃有效期为一周,-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长,应考虑更换使用-20度保存的10% APS。
一、制备凝胶
以下步骤为制备8×10cm厚度1.0mm胶
- 参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。
- 按照表一将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合;最后加入10%APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。
- 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液(对于mini-gel,凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可),然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5cm的水层,使凝胶表面保持平整。
- 静置10~20分钟,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后,说明凝胶已聚合
表一:TBE-PAGE分离胶配方表(总体积5mL,适用于厚度1.0mm小板胶)
注:凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。最佳DNA分离范围 凝胶浓度 各组份体积(ml) 灭菌水 30%PAA(29∶1) 5×TBE 10%APS TEMED 70~450bp 6% 3 1.0 1.0 0.05 0.005 60~460bp 8% 2.66 1.34 1.0 0.05 0.005 50~300bp 10% 2.33 1.67 1.0 0.05 0.005 40~200bp 12% 2 2.0 1.0 0.05 0.005 25~150bp 15% 1.5 2.5 1.0 0.05 0.005 5~100bp 20% 0.66 3.34 1.0 0.05 0.005 - 去除覆盖在分离胶上的水层;按照表二将不同体积成分在一个小烧杯或试管中混合;最后加入10%过硫酸铵和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。
表二:TBE-PAGE 4%浓缩配方表(总体积1.5mL,适用于1.0mm厚度胶)凝胶浓度 各组份体积(ml) 灭菌水 30%PAA(29:1) 5×TBE 10%APS TEMED 4% 1.0 0.2 0.3 0.02 0.002 - 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端;将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。
- 静置30~60分钟,等待浓缩胶聚合。
注:凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
二、电泳
- 1×TBE电泳液配制:取100mL 5×TBE,加蒸馏水400mL,即配成500mL 1×TBE。将凝胶板固定在电泳装置上,往上槽和下槽中加入足够1×TBE电泳液。用1mL吸头冲洗加样孔1~2次。
- 取待测样品,加入相应体积6×Native PAGE DNA上样液,如5μL样品加1μL上样液,短暂离心后取5~10μL上样。TBE-PAGE中判断双链DNA大小可以选择20bp DNA ladder(20~500bp,货号:RFT312)作为DNA Marker。
- 连接电源线,打开电源开关。200 V稳压电泳。至二甲苯菁指示前沿到达凝胶三分之二位置时结束电泳。
TBE-PAGE电泳 恒电压 起始电流 结束电流 电泳时间 200 V 20-25 mA/板胶 10-15 mA/板胶 70+min
三、染色
- 漂洗:玻璃板上拆下凝胶后,适量蒸馏水漂洗3~5分钟。
- 染色液配制:TBE-PAGE胶可以使用EB或RealGood类染料后染染色,以下程序用RealGood Red核酸染料进行染色。即用型染色液配制:
100mL即用型RealGood核酸染色液 1×TBE 100mL RealGood Red核酸染料 20μL - 染色:凝胶浸泡于即用型染色液中,常温避光摇床40~60rpm染色30分钟。
- 为何SSCP-PCR带型有复合条带?
- 可能是残留的PCR引物跟单链的DNA结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。
- 可能是PCR产物用量过高,彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4~8倍后使用。
- 可能是残留的PCR引物跟单链的DNA结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。
- 如何提高电泳分辨率?
可以在配胶时加入甘油(终浓度为5%~10%),因为甘油是弱变性剂,能部分展开DNA折叠结构,增加表面积,增加电泳时位移差异。但加入甘油后粘性变大,电泳速度变慢,因此只适合常温电泳使用,不要4℃电泳。如果条件允许,最好同时做加甘油和不加甘油的电泳实验。
DNA在PAGE中的有效分离范围 | ||||||
PAGE浓度 | DNA有效期分离范围 | 二甲苯菁 | 溴酚蓝 | 二甲苯菁 | 溴酚蓝 | |
%(w/v) C3.3 | 双链bp | 单链nt | 染料迁移率相当于双链DNA片段粗略大小 | 染料迁移率相当于单链DNA片段粗略大小 | ||
3.5 | 1000-2000 | 750-2000 | 460 | 100 | 150 | 45 |
5.0 | 80-500 | 200-1000 | 260 | 65 | 130 | 35 |
8.0 | 60-400 | 50-400 | 160 | 45 | 75 | 19 |
12.0 | 40-200 | 30-300 | 70 | 20 | 55 | 15 |
15.0 | 25-150 | 10-150 | 60 | 15 | 52 | 10 |
20.0 | 6-100 | 8-120 | 45 | 12 | 50 | 8 |
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