产品货号:
RFT312
中文名称:
20bp DNA ladder(20~500bp)
英文名称:
20bp DNA marker(20-500bp)
产品规格:
250μL
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本制品是由13条带状双链DNA条带组成的精准定量Marker,适用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中DNA条带大小和含量的分析。13条带的大小分别为20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、300、400、500bp。其中100bp和200bp条带为加亮带,含量为100ng/5μL,其余条带浓度为50ng/5μL。
本制品为双链DNA Marker,适用于非变性的PAGE电泳和琼脂糖凝胶电泳,不适用于尿素PAGE电泳。由于片段较小,如使用琼脂糖分离,建议使用高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离。
组分 | 规格 |
20bp DNA ladder | 250μL |
6×Native-PAGE DNA上样缓冲液 | 1mL |
6×DualColor DNA loading buffer | 1mL |
保存:4℃,有效期6个月。
按照每次上样5μL计算,250μL的本制品可以使用50次。
一、TBE-PAGE凝胶分离:
- 制备凝胶步骤:
- 参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。
- 按照表一将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合;最后加入10%APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。
- 20bp DNA ladder适用于配制20%TBE-PAGE胶。
- 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液(对于mini-gel,凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可),然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-2cm的无水乙醇,使凝胶表面保持平整。
- 静置10~20分钟,待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面后,说明凝胶已聚合
表一:TBE-PAGE分离胶配方表(总体积5mL,适用于1mm厚度小板胶)最佳DNA分离范围 凝胶浓度 灭菌水 30% PAA(29:1) 5×TBE 10% APS TEMED 70~450bp 6% 3mL 1mL 1mL 50μL 5μL 60~460bp 8% 2.66mL 1.34mL 50~300bp 10% 2.33mL 1.67mL 40~200bp 12% 2mL 2mL 25~150bp 15% 0.5mL 2.5mL 5~100bp 20% 0.66mL 3.34mL - 去除覆盖在分离胶上的乙醇;按照表二将不同体积成分在一个小烧杯或试管中混合;最后加入10%过硫酸铵和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。
表二:TBE-PAGE 4%浓缩配方表(总体积1.5mL,适用于1mm厚度小板胶)凝胶浓度 灭菌水 30% PAA(29:1) 5×TBE 10% APS TEMED 4% 1mL 200μL 300μL 20μL 2μL - 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端;将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。
- 静置30~60分钟,等待浓缩胶聚合。
注:凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
- 参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。
- 电泳:
- 将凝胶板固定在电泳装置上,往上槽和下槽中加入1×TBE电泳液,1mL吸头冲洗加样孔1~2次。
- 取待测样品,加入相应体积6×Native PAGE DNA上样缓冲液,如5μL样品加1μL上样缓冲液,短暂离心后取5~10μL上样。20bp DNA ladder 1mm厚10齿梳子上样5μL,其余梳齿和厚度凝胶适量调整上样量。
- 连接电源线,打开电源开关。200V稳压电泳。至二甲苯菁指示前沿到达凝胶三分之二位置时结束电泳(此时溴酚蓝指示前沿已经跑出凝胶,不可见)。
TBE-PAGE电泳 恒电压 起始电流 结束电流 电泳时间 200 V 20-25 mA/板胶 10-15 mA/板胶 70+min
- 将凝胶板固定在电泳装置上,往上槽和下槽中加入1×TBE电泳液,1mL吸头冲洗加样孔1~2次。
- 染色:
- 漂洗:玻璃板上拆下凝胶后,适量蒸馏水漂洗3~5分钟。
- 染色液配制:
TBE-PAGE胶可以使用EB或RealGood类染料后染染色,以下程序用RealGood Red核酸染料进行染色。即用型染色液配制:成分 用量 1×TBE 100mL RealGood Red核酸染料 20μL - 染色和观察:
凝胶浸泡于即用型染色液中,常温避光摇床40~60rpm染色30分钟。紫外光下观察。
- 漂洗:玻璃板上拆下凝胶后,适量蒸馏水漂洗3~5分钟。
二、琼脂糖凝胶分离:
- 琼脂糖凝胶制备:
由于片段较小,建议选用高分辨率琼脂糖制胶。以下步骤以制备50mL 3%凝胶为例:
称取1.5g琼脂糖于玻璃三角瓶中,加入50mL 1×TAE,5μL RealGood Red核酸染料或其他核酸染料(如EB,GoldView),混匀,盖好瓶盖,微波炉中火加热至沸腾,轻摇混匀,重复1~2次至琼脂糖完全溶解,无可见颗粒。倒入制胶容器中,插好梳子,常温凝固30~50分钟至凝胶完全凝固。 - 电泳:
取待测样品,加入相应体积6×DualColor DNA loading buffer,如10μL样品加2μL上样缓冲液,短暂离心后取5~10μL上样。20bp DNA ladder 1mm厚10齿梳子上样5μL,其余梳齿和厚度凝胶适量调整上样量。
建议电泳条件:凝胶浓度为3%,电泳电压8-10 v/cm(单位电压指电泳槽阴阳极之间的距离电压,如阴极阳极之间的距离为20cm,可以用160-200 V电压进行稳压电泳),待溴酚蓝指示前沿距离凝胶末端2cm时终止电泳,电泳时间35~40分钟。
注:3%琼脂糖TAE电泳中,溴酚蓝大小约为20bp,二甲苯菁大小约200bp。 - 紫外灯下观察条带:
注:使用EB或Goldview染料时,由于染料本身带正电荷较多,随着电泳时间的延长,染料会向阴极聚集,导致小片段核酸结合的染料含量降低,会出现小片段的DNA片段紫外灯下亮度变弱或不可见。此时可以将胶浸泡于含有染料的1×TAE缓冲液中染色15~20分钟即可看到小片段。 - 实验示例:
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