产品货号:
RFT203
中文名称:
DNA尿素PAGE电泳试剂盒
英文名称:
DNA Urea PAGE Electrophoresis Kit
产品规格:
60次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本试剂盒包含凝胶制备及电泳所需的全部试剂,用户只需自备制胶器具和蒸馏水,即可配制各种浓度的PAGE胶,使用方便。
DNA尿素PAGE电泳是研究寡核苷酸电泳的重要研究手段。可以检测2-500碱基的寡核苷酸片段,理论上可以分辨出相差一个核苷酸的片段。
本试剂盒配胶具体数量与凝胶浓度和凝胶厚度有关。按照每次制备10%凝胶(10×8cm,1mm厚度)计算,试剂盒可使用至少60次。
一、制备凝胶
10% APS配制-5mL:将0.5g APS干粉溶于5mL灭菌水中,彻底溶解后分装,1mL/支,-20℃备存,每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间,以防失效。10% APS在4℃有效期为一周,-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长,应考虑更换使用-20℃保存的10% APS。
二、电泳
三、染色
相关搜索:DNA尿素PAGE电泳试剂盒,TBE-Urea-PAGE,PAGE电泳,DNA Urea PAGE Electrophoresis Kit
DNA尿素PAGE电泳是研究寡核苷酸电泳的重要研究手段。可以检测2-500碱基的寡核苷酸片段,理论上可以分辨出相差一个核苷酸的片段。
名称 | 规格 | 保存条件 |
40% PAA(29:1) | 100mL | 4℃ |
10×TBE | 500mL | RT |
尿素(电泳级) | 220g | RT |
APS(干粉) | 5mL | RT(配制后-20℃贮存) |
TEMED | 0.5mL | 4℃,避光 |
2×TBE尿素上样缓冲液(尿素变性胶) | 1mL | 4℃ |
本试剂盒配胶具体数量与凝胶浓度和凝胶厚度有关。按照每次制备10%凝胶(10×8cm,1mm厚度)计算,试剂盒可使用至少60次。
一、制备凝胶
10% APS配制-5mL:将0.5g APS干粉溶于5mL灭菌水中,彻底溶解后分装,1mL/支,-20℃备存,每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间,以防失效。10% APS在4℃有效期为一周,-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长,应考虑更换使用-20℃保存的10% APS。
- 参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。
- 分离胶配制:根据表格一,将不同体积的成分混合,漩涡搅拌至尿素彻底溶解。
表一.TBE-尿素PAGE分离胶配方表(总体积5mL,适用于厚度1.0mm小板胶)单链DNA长度 最佳凝胶浓度 尿素 40%PAA(29:1) 10×TBE 补水至 10%APS TEMED 200~1000nt 5% 2.1g 0.625mL 0.5mL 5mL 50μL 5μL 50~400nt 8% 1mL 40~350nt 10% 1.25mL 30~300nt 12% 1.5mL 10~150nt 15% 1.875mL 8~120nt 20% 2.5mL - 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液(对于8×10cm凝胶,凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm即可),然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1~2cm的水层,使凝胶表面保持平整。
- 静置10~20分钟,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后,说明分离胶已聚合。
- 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
- 去除覆盖在分离胶上的水层,用滤纸吸干水分。
- 按照表二将不同体积成分在一个小烧杯中混匀;加入10% APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。
表二.TBE-尿素PAGE 4%浓缩配方表(总体积2mL,适用于1.0mm厚度胶)凝胶浓度 尿素 40%PAA(29:1) 10×TBE 灭菌水 10%APS TEMED 4% 0.84g 0.2mL 0.2mL 至2mL 20μL 2μL - 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达短玻璃板的顶端;将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。
- 静置30~60分钟,等待浓缩胶聚合。
- 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
二、电泳
- 1×TBE电泳液配制:
取50mL 10×TBE,加蒸馏水450mL,即配成500mL 1×TBE。将凝胶板固定在电泳装置上,向内槽和外槽中加入足够1×TBE电泳液。用1mL吸头冲洗加样孔1~2次。
注:试剂盒配套的10×TBE缓冲液仅够配制凝胶用,电泳用1×TBE电泳缓冲液请自己制备。 - 样品处理:
取待测样品,加入等体积2×TBE尿素上样缓冲液。如5μL样品加5μL上样缓冲液,短暂离心后70℃处理5分钟后立即冰浴,取5~10μL上样。
TBE-Urea-PAGE中判断单链DNA大小可以选择单链DNA Ladder(20~75nt,货号:RFT202)作为分子量标准。 - 200 V稳压电泳,等待上样缓冲液的溴酚蓝指示前沿到凝胶底部时终止电泳,取出凝胶进行后续实验。
恒电压 起始电流 结束电流 电泳时间 200V 15~20 mA/板胶 10~15 mA/板胶 60+ min PAGE浓度 DNA有效分离范围 二甲苯菁 溴酚蓝 二甲苯菁 溴酚蓝 %(W/V) 双链(bp) 单链(nt) 染料迁移率相当于
双链DNA片段粗略大小染料迁移率相当于
单链DNA片段粗略大小3.5 1000~2000 750~2000 460 100 150 45 5.0 80~500 200~1000 260 65 130 35 8.0 60~400 50~400 160 45 75 19 12.0 40~200 30~300 70 20 55 15 15.0 25~150 10~150 60 15 52 10 20.0 6~100 8~120 45 12 50 8
三、染色
- 漂洗:拆下凝胶后,适量蒸馏水漂洗3~5分钟。
- 单链DNA可以用单链DNA PAGE电泳染色试剂盒(货号:RFT204),核酸PAGE电泳染色试剂盒(货号:RFT205)或核酸快速银染试剂盒(货号:RFT206)进行染色,也可以选择使用核酸染料进行染色。
- 使用核酸染料染色方法:
TBE-Urea-PAGE胶推荐使用RealGood类染料后染染色,以下程序用RealGood红色核酸染料(货号:RFT232)进行染色。- 即用型染色液配制(配制量:100mL)
即用型RealGood Red核酸染色液 1×TBE 100mL RealGood Red核酸染料 20μL - 染色:凝胶浸泡于即用型染色液中,常温避光摇床40~60rpm震荡染色30分钟。
- 观察:紫外灯或蓝光仪上观察条带。
- 即用型染色液配制(配制量:100mL)
- 使用单链DNA PAGE电泳染色试剂盒(货号:RFT204)染色:
15% Urea-PAGE 1×TBE 200V 55min
Lane 1-7为20,25,30,35,40,50,75nt ssDNA上样量为1μg;
Lane 8,9,10 ssDNA Marker(20~75nt)上样量为5μL。 - 使用核酸PAGE电泳染色试剂盒(货号:RFT205)染色:
15%尿素变性胶分离单链DNA
Lane 1-7为20,25,30,35,40,50,75nt ssDNA上样量为1μg;
Lane 8 ssDNA Marker(20~75nt)上样量为5μL。
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