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DNA非变性PAGE电泳试剂盒图片
产品货号:
BTN100205
中文名称:
DNA非变性PAGE电泳试剂盒
英文名称:
DNA Native-PAGE Kit
产品规格:
30次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价

本制品就是专门用于DNA非变性PAGE的试剂盒,一站式提供DNA非变性PAGE电泳所需的试剂,用户只需要准备去离子水和样品,不需要单独优化各种条件,十分方便。




在非变性PAGE中,DNA的迁移率除跟长短相关外,还跟其构象和结合的蛋白质相关,因此DNA的非变性PAGE电泳是研究SSCP-PCR(单链PCR片段构象多态性)和凝胶滞阻(Gel Shift)的重要研究手段。




  • 安全,免去了实验人员接触粉末状的有毒物品丙烯酰胺。
  • PAGE电泳后可直接用于银染等后续试验。
  • 可以用于SSCP和Gel-Shift实验。
  • 本制品足够30次mini PAGE凝胶电泳。



组分规格
2×DNA非变性PAGE上样液1.5mL
丙烯酰胺60g
甲叉双丙烯酰胺2g
10×TBE电泳液250mL
TEMED1.5mL
过硫酸铵1g

保存:室温,其中2×DNA非变性PAGE上样液需置于-20℃保存,有效期1年。


下面的操作步骤是以SSCP-PCR的非变性PAGE电泳为例,其他应用请相应修改相关参数。
  • PAGE浓度的选择
    根据SSCP-PCR和Gel-Shift的DNA长度选择PAGE凝胶的浓度。5%的PAGE的有效分辨范围为80~500bp、8%的PAGE的有效分辨范围为60~400bp、12%的PAGE的有效分辨范围为40~200bp。
  • 体积的选择
    SSCP-PCR检测需要长约30~40cm的测序胶板,Gel-Shift实验一般只使用长度为8~10cm的mini凝胶,可以结合梳子的厚度,计算所需PAGE胶的体积。
  • 配制PAGE胶
    下面以配制100mL PAGE胶为例计算用量,配制更大体积的胶则需以此用量为基础按比例增加。
    • 新鲜配制10%的APS:称量约0.1克硫酸铵干粉到一个1.5mL EP管中,按每0.1克过硫酸铵干粉加1mL自备去离子水的比例将水加到管中,摇晃到硫酸铵粉末全部溶解。配制好的10%的APS溶液可以在4℃存放一周,超过一周不能再用。
    • 新鲜配制30%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液:将2g甲叉双丙烯酰胺倒入到装有60g丙烯酰胺的250mL棕色塑料瓶中,天平上去皮,加入146mL自备的去离子水,充分摇晃直到溶解(约需10~20分钟)。此溶液简称为30% AB溶液(29:1),最好在一个月内用完,4℃保存。
    • 配SSCP PAGE胶:在一个250mL的三角瓶中,先按下表的用量加入去离子水、30% AB溶液和10×TBE电泳液。丙烯酰胺单体溶液具有神经毒性,一定要戴手套操作。
      PAGE胶浓度去离子水(mL)30% AB溶液(mL)10×TBE电泳液总体积
      5%73.416.610mL100mL
      6%70.020.0
      7%66.723.3
      8%63.326.7
      9%60.030.0
      10%56.733.3
      11%53.336.7
      12%50.040.0
      • 有大量文献报道PAGE胶中加入5%~10%的甘油能提高SSCP分析时某些位点的分辨率。如果选择加入10%的自备甘油,则减少去离子水的用量10mL,同时加入10mL甘油原液。
    • 摇晃混匀。最好能抽真空10~15分钟以去除溶液中的氧气(氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应),无条件也可以不脱氧。
    • 加入500μL 10%APS和100μL TEMED,迅速摇匀后倒胶。
    • 在PAGE胶的液面距离达到顶部时停止灌胶,插入梳子。
    • 室温聚合30~60分钟(低温抑制聚合反应,故最好室温)。
    • 待PAGE胶凝固后拔出梳子,用1×TEB液冲洗加样孔。
    • 放4℃冰箱预冷30分钟~12小时。为了防止PAGE胶收缩,最好在其顶部加少量1×TBE缓冲液。使用预冷的PAGE胶有利于单链DNA在电泳时保持其构型,这些构型靠DNA序列间的微弱的链内互补形成,对温度很敏感。温度越高,这些微弱相互作用越不稳定。
  • 将预冷后的PAGE凝胶板固定在电泳装置上,往上槽和下槽中加入足够1×TEB电泳液。
  • 取3~5μL SSCP-PCR样品,加入等体积2×DNA非变性PAGE上样液,85℃处理5分钟后冰浴。用前短暂离心后取2μL上样。上样量跟检测方法的灵敏度相关,上述上样量是针对核酸银染检测法。
  • 连接电源线,打开电源开关。如果PAGE中不含甘油,则使用25W的功率,电泳5~7小时(对3~40cm长的PAGE胶而言)。如果使用含甘油的PAGE,则使用8W的功率,电泳16~18小时。由于温度变化过大会改变DNA构型,所以电泳时最好能保持恒温。对不含甘油的PAGE,最好恒温在4℃、对含甘油的PAGE,最好恒温在25℃。
  • 终止电泳,取出凝胶进行后续的银染处理。不建议使用灵敏度低于银染的方法,因为SSCP异构体的数量都比较少,一般方法没法检测到。



  • 为何SSCP-PCR带型有复合条带?
    • 可能是残留的PCR引物跟单链的DNA结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。
    • 可能是PCR产物用量过高,彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4~8倍后使用。
  • 如何提高电泳分辨率?
    可以在配胶时加入甘油(终浓度为5%~10%),因为甘油是弱变性剂,能部分展开DNA折叠结构,增加表面积,增加电泳时位移差异。但加入甘油后粘性变大,电泳速度变慢,因此只适合室温电泳使用,不要4℃电泳。如果条件允许,最好同时做加甘油和不加甘油的电泳实验。

相关搜索:DNA非变性PAGE电泳试剂盒非变性DNA电泳DNA非变性电泳非变性PAGE电泳Native-PAGESSCP-PCRGel-ShiftDNA Native-PAGE Kit
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