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本制品是一种使用百奥莱博的BalbMulti Multiplex PCR Kit（货号：YTB4061）时，克服因模板高GC含量所导致的PCR扩增障碍的PCR增强剂。高GC含量DNA片段的扩增一直是分子生物学操作过程中的一个难点，本制品可用于含有肝素、柠檬酸钠以及EDTA等抗凝血的直接PCR反应，从而大大提高了高GC含量DNA模板的扩增效率及扩增的特异性。本制品也可以用于普通PCR时扩增高GC含量的目的片段。

2×BalbMulti PCR Enhancer还可以适用于商业化的常见的多种耐血DNA聚合酶，如百奥莱博的BloodTaq DNA Polymerase (Blood-resistant，货号：YTB4081)和BloodTaq HF DNA Polymerase (Blood-resistant，YTB4082)，NEB的Hemo KlenTaq等。本制品直接扩增EDTA抗凝血中高GC含量基因的效果显著优于常用的甜菜碱、DMSO等的效果。

• 在使用本制品的同时，必须同时使用和BalbMulti Multiplex PCR Kit配套的最终浓度为1×的PCR Buffer。
  
• 本制品溶解时如果有结晶状沉淀物，可以在50℃水浴温育片刻促进溶解，并确保完全溶解后使用。
  
• 请尽量使用新近采集的抗凝血样本进行检测；如果是冻存的样本，尽量避免反复冻融，以免在冻融过程中导致目的基因的断裂和降解。
  
• 设置PCR反应体系时，抗凝血的推荐用量为PCR体系总体积的5～10%左右，可以直接添加到PCR体系中，无需进行任何额外处理。
  
• PCR反应结束之后，建议3000～5000g离心3～5min以沉淀血细胞碎片，便于吸取上清用于电泳分析等。
  注意：由于抗凝血本身的原因，PCR结束后在PCR管底部会出现透明凝胶状物质，此为正常现象。
  
• 由于PCR反应非常灵敏，可以扩增目的基因序列超过1000万倍，在操作时请注意避免微量待扩增DNA的污染，并尽量考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。

• PCR反应参数的设置请参照特定的BalbMulti Multiplex PCR Kit的说明书进行。通常对于扩增高GC含量的DNA模板，延伸时间可以比常规的延伸时间适当延长一些。
  
• 反应体系的设置可以参考特定的BalbMulti Multiplex PCR Kit的PCR反应体系进行，仅仅添加反应总体积一半的本试剂盒所提供的BalbMulti PCR Enhancer (2X)即可。可以参考如下反应体系设置PCR反应：
  
  • 融解并混匀PCR反应所需的各种溶液。将BalbMulti DNA polymerase置于冰浴上或冰盒内。
    
  • 参考下表在冰浴上设置PCR反应体系(如果有多个类似的PCR反应，可以先配制大体积的包含水、buffer、dNTP和BalbMulti酶的混合物，然后分装到各PCR反应管内。根据情况，有时混合物中也可以包括引物)：
    

    试剂	20μL体系	50μL体系	终浓度
    Nuclease-Free Water	(5-x-0.4n)μl	(12.5-x-n)μl	-
    10X BalbMulti PCR Buffer	2μL	5μL	1X
    BalbMulti PCR Enhancer (2X)	10μL	25μL	-
    dNTP (2.5mM each)	2μL	5μL	0.25mM each
    Primer mix (10μM each)	0.4μL×n	1μL×n	0.2μM each
    Template	xμl	xμl	-
    Control template and primer mix	-	-
    Multiplex DNA polymerase	1μL	2.5μL	-
    总体积	20μL	50μL	-

    
    注：
    ① n代表多重PCR时使用的引物对种类的数量，即拟扩增片段种类的数量。
    ② 关于模板使用量。DNA模板的用量对PCR扩增有很大影响。对于高复杂度的DNA样本，如哺乳动物基因组DNA，推荐在20μL反应体系中使用5ng至0.5μg模板DNA。对于低复杂度的DNA，如λDNA或质粒DNA，推荐在20μL反应体系中使用5pg至5ng的模板DNA。
    ③ 关于PCR模板为抗凝血的情况。PCR模板为抗凝血时，模板的用量一般为PCR反应体系总体积的1～20%，建议起始使用量为5%；如果抗凝血多重PCR反应检测的是基因组的DNA片段，可以适当减少抗凝血用量；如果抗凝血多重PCR反应检测的是血液样品中某种病毒或细菌等微生物的目的DNA片段，建议使用50μL的PCR体系，并使用较大的模板血量。对于高GC含量的PCR扩增，可以使用扩增高GC含量DNA片段的2×BalbMulti PCR Enhancer，或者尝试向PCR体系中加入终浓度1～10% (体积百分比)的DMSO。
    ④ 关于PCR模板为植物样品的情况。PCR模板为抗凝血时，对于20μL和50μL PCR反应体系，植物样品的推荐用量分别为0.1～1mm和0.3～3mm直径叶片或类似大小其它比较柔嫩的植物组织。如果模板为植物种子，尽量使用鲜嫩的植物种子。用干净的解剖刀去掉种子外壳，剪下直径约0.5～2mm的组织直接放入PCR管内；若种子太小，如番茄种子，可直接使用1-2粒完整的种子放入PCR管内进行扩增。50μL PCR体系，植物叶片或是种子直径不宜超过3mm，太多模板易造成PCR抑制成分偏多，影响PCR效果。推荐取两份植物组织样品进行平行的PCR实验，以降低取样的不稳定性。为确保取样的均一性，建议使用专用的打孔器或解剖刀进行取样，并注意防止取样过程中的交叉污染。每一次取样，可以用2%的次氯酸钠溶液清洗打孔器或解剖刀。对于高GC含量的PCR扩增，可以尝试向PCR体系中加入终浓度1～10% (体积百分比)的DMSO。
    ⑤ 关于引物浓度。通常引物的终浓度为0.2μM时可获得良好的PCR扩增效果，但也可以根据情况在0.05～0.4μM范围内调整引物的终浓度。扩增效率低的情况下，可提高引物浓度；发生非特异性扩增时，可降低引物浓度。
    
  • 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
    
  • 如果所使用的PCR仪有热盖则省略本步骤。如果PCR仪没有热盖，则在管内滴入一滴矿物油(货号：YT399)。
    
  • 把设置好的PCR反应体系置于PCR仪上，开始PCR反应。PCR反应参数的设置可以参考该BalbMulti Multiplex PCR Kit的常规参数，同时可以考虑适当延长延伸时间。