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本制品结合了饱和染料EvaGreen和抗体酶的优点，是一款适用于高分辨率熔解曲线（HRM）分析的专业试剂盒。本试剂盒是一种2×PreMix，PCR反应液配制十分简单方便；具有分辨率高和模板高度适应性等特点。

与SYBR Green不同，EvaGreen在高浓度情况下不会抑制PCR反应；可以使双链PCR产物的结合量达到饱和状态，所以称为“饱和染料”。不会产生SYBR Green的“染料重排”现象，能够很好的区分扩增产物之间单个碱基的差异。

本试剂盒可用于已知SNP分析，未知突变基因扫描和甲基化PCR分析等研究。

• 采用了抗体修饰的热启动DNA聚合酶，具有高扩增效率，高扩增特异性和宽广的可信范围的特点。
  
• EVA Green染料在饱和状态下具有很高的溶解曲线分辨率，可以区分单个碱基的变异。
  
• 独特的Buffer体系进一步增加了溶解曲线的稳定性，提高了扩增的特异性。
  
• 本制品附带ROX Reference Dye，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，方便客户针对不同型号荧光定量PCR仪时选择相应浓度使用。

SYBR Green是目前被广泛应用于荧光定量PCR分析的荧光染料，但由于对PCR的抑制较严重，会被控制在较低的使用浓度，SYBR Green与双链DNA的结合处于非饱和状态，所以称为“非饱和染料”。SYBR Green的这种性质会导致在“染料重排”现象的发生，从而影响熔解曲线的分辨率，所以不能够通过熔解曲线区分扩增产物之间单个碱基之间的差异。

EvaGreen是一种同时适用于荧光定量PCR和HRM分析的新一代染料。这种染料通过一种被称为“按要求释放”的全新机制，选择性的结合双链DNA。这一机制保证了较低的PCR抑制作用，同时也允许在染料饱和浓度下进行分辨单碱基差异的HRM分析。

收到本试剂盒后，请立即置于-20℃避光保存。从-20℃取出使用时，将冻存的2×HRM Analysis PreMix和50×ROX Reference Dye溶解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用，须彻底混匀后重新冷冻（在解冻过程中盐会出现分层现象，未混匀进行冷冻，盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用，可在2～8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。

• 本试剂盒中含有荧光染料EvaGreen，保存本试剂盒或配制PCR反应液时应避免强光照射。
  
• 如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀，请不要使用振荡器进行混匀，尽量避免出现泡沫，并经瞬时离心后使用。
  
• 引物纯度对反应特异性影响很大，建议使用PAGE级别以上纯化的引物。
  
• 20μL反应体系中，基因组DNA模板的使用量一般小于100ng，并尽量保持不同反应之间有相同的模量。模板纯度，OD₂₆₀/₂₈₀ 1.6~2.0，OD₂₆₀/₂₃₀ 1.5~2.0。
  
• 由于HRM具有很高的灵敏性，因此在条件允许的情况下推荐使用50μL反应体系，大的反应体系可以提高反应重复性，减少实验误差对熔解曲线的负面影响。
  
• 引物设计：较短的PCR产物可以提高HRM的分辨率；因此在设计PCR引物时，遵循普遍的原则外，尽量保持产物长度在80～120之间。SNP位点尽量处在PCR产物序列中间位置。

• 建立HRM PCR反应体系：
  请注意将2×HRM Analysis PreMix和50×ROX Reference Dye避光保存。
  
  • 溶解2×HRM Analysis PreMix （如果保存在-20℃)，50×ROX Reference Dye，模板，引物和RNase-Free ddH2O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀。
    
  • 建议置于冰上进行HRM PCR反应液的配制，反应体系如下：
    

    成分	50μL体系	20μL体系	终浓度
    2×HRM Analysis PreMix	25μL	10μL	1×
    正向引物（10μM）	1.5μL	0.6μL	0.3μM
    反向引物（10μM）	1.5μL	0.6μL	0.3μM
    模板	－	－	－
    50×ROX Reference Dye	－	－	－
    RNase-Free ddH2O	至50μL	至20μL	－

    • 常用体系为20μL，在条件允许的情况下可50μL反应体系，大的反应体系可以减少实验误差对熔解曲线的负面影响。
      
    • 引物终浓度为0.3μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发生非特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的，可以在0.2～0.5μM范围内调整。
      
    • 由于HRM反应较灵敏，须尽量保持不同样本之间有相同的模板量。
      
    • 几种常见仪器的最适ROX Reference Dye浓度如下：
      

      仪器	终浓度
      ABI 7900HT	5×（例如：5μL ROX/50μL体系）
      ABI 7500 Fast	1×（例如：1μL ROX/50μL体系)
      Roche LightCycler 480，Qiagen Roter-Gene	无需添加

  • 盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有组分均在管底。
• 进行PCR反应
  将反应体系置于荧光定量PCR仪中，选择并设置扩增程序，开始反应。
  建议采用两步法PCR反应程序进行反应。当出现模板浓度过低引起非特异扩增，引物Tm值较低导致的扩增效率低下或扩增曲线重现性不佳等现象时，建议尝试进行三步法PCR扩增反应。
  
  • 两步法反应程序：
    

    阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
    预变性	1×	95℃	2min	预变性	否
    PCR反应	40×	95℃	10sec	变性	否
    		60℃	30sec	退火/延伸	是
    熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）

    • 请先使用60℃ 30sec进行扩增，如出现非特异性扩增，可尝试在60～66℃范围内优化，提高反应特异性。
      
    • HRM在熔解曲线分析时，一般设置为0.02～0.1℃收集一次荧光。
    
    
  • 三步法反应程序：
    

    阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
    预变性	1×	95℃	2min	预变性	否
    PCR反应	40×	95℃	10sec	变性	否
    		60℃	20sec	退火	否
    		72℃	30sec	延伸	是
    熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）

    • HRM在熔解曲线分析时，一般设置为0.02～0.1℃收集一次荧光。