产品目录

本试剂盒适用于对各种动物细胞进行RNA提取(如cell line化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS细胞等)，无需提RNA，可直接进行qPCR表达分析，用时短，操作简单，出错率低，最短只需1.5小时就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。试剂盒中包含反转录以及荧光检测试剂，可轻松地进行基因表达分析。

• 使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用，FCD Lysis Buffer和FCD Washing Buffer未开封时请置于-20℃保存，溶解后置于4℃保存。。
  
• 实验时，请尽量使用无污染的耗材，避免污染。
  
• 本制品避免反复冻融，配制时应避免强光照射。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途。

• 裂解产物的制备：
  
  • 将试剂放置室温下融化，使用前上下颠倒，轻轻混匀，并轻微离心后使用，避免起泡。
    
    • 没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配制试剂等情况会导致反应性能下降。
  • 将细胞转移至离心管中，5000rpm离心2min收集细胞，充分吸除培养基。若贴壁细胞在96孔板中培养，可直接吸除培养基。
    
    • 对50μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔10⁴，该试剂盒可使用范围是10¹～10⁵cells，若细胞数量较多，可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase I溶液的用量。
      
    • 不同细胞的离心条件不同，请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。
  • 各个孔内加入150μL FCD Washing Buffer，吸打清洗细胞，5000rpm离心2min，吸尽FCD Washing Buffer。
    
  • 各孔中加入48μL FCD Lysis Buffer溶液，2μL DNase I溶液，室温吸打混匀后静置5min，孵育后加入2.5μL FCD Stop Solution，吸打混匀5次左右，即可得到裂解产物，细胞数量超过10⁵cells时可能会有裂解残留物属正常现象。
    
    • 对50μL的裂解液需加入2.5μL的FCD Stop Solution。依实验需要，加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。
      
    • 细胞裂解产物溶液长期保存时，请置于-20℃
• 反转录：
  
  • 室温融化4×Histan FCD RT Mix后轻微颠倒混匀，置于冰上并按下表配制反应体系：
    

    成分	用量	终浓度
    4×Histan FCD RT Mix	5μL	1×
    裂解产物	x μL	-
    RNase-free H2O	至20μL	-

    • 避免吸入细胞碎片，推荐使用量为2～5μL，最大不超过反应体系的45%。
  • 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表程序进行反转录反应。
    

    反应温度	反应时间
    55℃	15min
    85℃	5min

    • 反转录温度推荐使用55℃，对于高GC含量模板或者复杂模板，可将反转录温度提高到60℃。反转录产物可直接进行下游RT-qPCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制，得到合适的Ct值(10～35)，可将产物稀释10～1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验，可放置于-20℃保存。
• 荧光定量PCR：
  
  • 反应体系配制：使用下列成分比例配制反应液(配制过程请于冰上进行)。
    

    成分	用量	终浓度
    2×Hiper FCD qPCR SYBR Master Mix	10μL	1×
    Forward Primer(10μM)	0.4μL	200 nM
    Reverse Primer(10μM)	0.4μL	200nM
    反转录产物	X μL	-
    RNase-free H2O	20μL	-

    • 反转录产物的加入量不要超过RT-qPCR体积的1/10。高浓度模板易导致非特异扩增，适当稀释5～50倍。模板推荐用量4μL，尽量不要超过6μL。反应性能较差时，可以在0.2～1.0μM范围内调整引物浓度。
  • 常规荧光定量PCR扩增程序(推荐)：
    

    循环步骤	温度	时间	循环数
    预变性	95℃	30sec	1
    变性	95℃	10sec	35～40
    退火/延伸	60℃	30sec
    熔解曲线阶段	仪器默认设置		1

  • 快速荧光定量PCR扩增程序：
    实验条件允许时，也可使用快速程序进行扩增
    

    循环步骤	温度	时间	循环数
    预变性	95℃	10sec	1
    变性	95℃	5sec	40
    退火/延伸	60℃	10sec
    熔解曲线阶段	仪器默认设置		1

    • 退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。快速程序适用于绝大多数基因，个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。