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本制品是以RNA为模板进行定量PCR反应的试剂盒。在实验的过程中，逆转录和定量PCR在同一反应管中进行，简化了实验操作，降低了污染的风险。本试剂盒以RNA为模板，使用基因特异性引物，利用耐热Histan III逆转录酶高效合成第一链cDNA，并搭配使用探针和Spec HotStart Taq DNA聚合酶，配合优化的缓冲体系能够特异灵敏的对RNA模板进行精确定量。

本试剂盒以预混的Mix形式提供，2×Histan III Probe buffer包含优化的缓冲体系和dNTPs等，优化了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，适用于荧光标记探针的高特异性检测系统。此外，Histan UH III Enzymes包含比例优化的Histan III反转录酶、RNase抑制剂及Spec HotStart Taq DNA聚合酶等。

• High Rox适用机型：ABI 5700,7000,7300,7700,7900HT Fast,StepOne,StepOne Plus
  
• Low Rox适用机型：ABI 7500,7500 Fast,ViiA7,QuantStudio 3 and 5,QuantStudio 6,7,12k Flex Stratagene MX3000P,MX3005P,MX4000P
  
• 不需要Rox校正的仪器型号：Bio-Rad CFX96,CFX384,iCycler iQ,iQ5,MyiQ,MiniOpticon,Opticon,Opticon 2,Chromo4 Eppendorf Mastercycler ep realplex,realplex 2 s;Qiagen Corbett Rotor-Gene Q,Rotor-Gene 3000,Rotor-Gene 6000 Roche Applied Science LightCycler 480,LightCycler 2.0;Lightcycler 96 Thermo Scientific PikoReal Cycler;Cepheid SmartCycler;Illumina Eco qPCR.

• 实验过程中请使用RNase free耗材。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

• 探针法RT-qPCR反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  2×Histan III Probe buffer	10μL	1×
  Histan UH III Enzymes	1μL	-
  50×Rox	0.4μL/-	-
  基因特异性正向引物(10μM)	0.4μL	0.2μM
  基因特异性反向引物(10μM)	0.4μL	0.2μM
  TaqMan Probe (10μM)	0.2μL	0.1μM
  模板RNA	1pg～1μg	-
  RNase-free ddH2O	至20μL	-

  • 所有试剂使用前应充分混匀。
    
  • 参比染料：Rox的添加，可根据不同仪器型号进行选择，具体可参考【适用机型】。
    
  • 引物浓度：通常引物终浓度为0.2μM，也可以根据情况在0.1～1.0μM之间进行调整。
    
  • 探针浓度：探针终浓度可在50～250nM之间调整。
    
  • 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
    
  • 模板稀释：一步法RT-qPCR灵敏度极高，推荐将模板稀释后(如稀释至2～5μL/样本)加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。
    
  • 反应体系：建议以大体系进行实验，如20μL或50μL。
• 探针法RT-qPCR反应程序：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  逆转录	50℃	15min	1
  预变性	95℃	30sec	1
  扩增反应	95℃	10sec	45
  	60℃	30sec

  • 对于含复杂二级结构或高GC含量的RNA模板，可将逆转录温度提高到55℃，有助于提升扩增效率和灵敏度。
    
  • 逆转录时间可以根据模板的复杂程度进行调整，时间为5min时可满足大多数基因的鉴定。
    
  • 不同的qPCR检测仪器所需的荧光信号采集时间不同，请根据最短时间限制进行设置。