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本制品是以RNA为模板进行定量PCR反应的试剂盒。在实验的过程中，逆转录和定量PCR在同一反应管中进行，简化了实验操作，降低了污染的风险。本试剂盒以RNA为模板，使用基因特异性引物，利用耐热Histan III反转录酶高效合成第一链cDNA，并以此为模板在Spec HotStart Taq DNA Polymerase作用下，配合优化的缓冲体系能够特异灵敏的对RNA模板进行精确定量。同时Buffer中额外添加了有效抑制非特异性PCR扩增的组分和提高扩增能力的促进因子，使定量PCR结果可以在宽广范围内更加真实有效。

本试剂盒包含2×Histan III SG buffer包含优化的缓冲体系和dNTPs等，优化了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，适用于SYBR Green标记的高特异性检测系统。此外，Histan UH III Enzymes包含比例优化的Histan III反转录酶、RNase抑制剂及Spec HotStart Taq DNA聚合酶等。

• 实验过程中请使用RNase-free耗材。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途。

• RT-qPCR反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  2×Histan III SG buffer	10μL	1×
  Histan UH III Enzymes	1μL	-
  50×ROX	0.4μL/-	1×/-
  正向引物(10μM)	0.4μL	0.2μM
  反向引物(10μM)	0.4μL	0.2μM
  模板总RNA	1pg～1μg	-
  RNase-free ddH2O	至20μL	-

  • 使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
    
  • 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μmol/L，也可以根据情况在0.1-1.0 μmol/L之间进行调整。
    
  • 参比染料：Rox的添加，可根据不同仪器型号进行选择，具体可参考“适用机型”。
    
  • 模板稀释：qPCR灵敏度极高，建议将模板进行稀释使用，控制CT值在20～30之间适宜。
    
  • 反应体系：推荐使用20μL或50μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
    
  • 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
• RT-qPCR反应程序：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  反转录	42℃	10min	1
  预变性	95℃	5min	1
  扩增反应	95℃	10sec	40
  	60℃	30sec
  熔解曲线	仪器默认设置		1

  • 反应程序针对实验需求可做适当调整。
    
  • 逆转录：对于一些极低丰度的基因可以将逆转录时间适当延长至15min。
    
  • 温度：对于含复杂二级结构或高GC含量的RNA模板，可将逆转录温度提高到55℃，有助于提升灵敏度。
    
  • 荧光信号采集：不同的qPCR检测仪器所需的荧光信号采集时间不同，请根据最短时间限制进行设置。
    
  • 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

• High Rox适用机型：ABI 5700,7000,7300,7700,7900HT Fast,StepOne,StepOne Plus;
  
• Low Rox适用机型： ABI 7500,7500 Fast,ViiA7,QuantStudio 3 and 5,QuantStudio 6,7,12k Flex;Stratagene MX3000P,MX3005P,MX4000P;
  
• 不需要Rox校正的仪器型号：Bio-Rad:CFX96,CFX384,iCycler iQ,iQ5,MyiQ,MiniOpticon,Opticon,Opticon 2,Chromo4;Eppendorf:Mastercycler ep realplex,realplex 2 s;Qiagen:Corbett Rotor-Gene Q,Rotor-Gene 3000,Rotor-Gene 6000;Roche Applied Science:LightCycler 480,LightCycler2.0,Lightcycler 96;Thermo Scientific:PikoReal Cycler;Cepheid:SmartCycler;Illumina:Eco qPCR.