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本制品是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。Mix中含有热启动Hiper DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg²⁺。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。本制品针对不同型号的实时荧光定量PCR仪，分别提供不同浓度的Rox参比液(High Rox/Low Rox)，用于校正孔与孔之间的荧光信号误差。

本制品采用的DNA聚合酶配体可以随温度变化实时调节DNA聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

• 推荐使用第一链cDNA合成反应预混液(去除gDNA)，以有效去除RNA样品中残留的基因组。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 在冰上配制qPCR反应体系：
  

  成分	20μL反应体系	50μL反应体系	终浓度
  2×Hiper SYBR Green qPCR MasterMix	10μL	25μL	1×
  正向引物(10μM)	0.4μL	1μL	0.2μM
  反向引物(10μM)	0.4μL	1μL	0.2μM
  50×Rox	0.4μL/－	1μL/－	1×
  模板DNA	X	Y	－
  无菌超纯水	至20μL	至50μL	－

  • 使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
    
  • 参比染料：Rox的添加，可根据不同仪器型号进行选择，具体可参考“适用机型”。
    
  • 引物浓度：通常引物终浓度为0.2μmol/L，也可以根据情况在0.1-1.0μmol/L之间进行调整。
    
  • 模板浓度：如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
    
  • 模板稀释：cDNA原液建议5～10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20～30个循环为好。
    
  • 反应体系：推荐使用20μL或50μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
    
  • 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
• qPCR扩增程序：
  

  ➤三步法程序：	➤两步法程序：
  步骤 温度 时间 循环数 预变性 95℃ 5min 1 变性 95℃ 10sec 40 退火 55～60℃ 20sec 延伸 72℃ 20sec	步骤 温度 时间 循环数 预变性 95℃ 5min 1 变性 95℃ 10sec 40 退火/延伸 60℃ 30sec

  • 高特异性可选择两步法，高效率扩增可选择三步法。
    
  • 预变性时间：根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至2min。
    
  • 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。
    
  • 荧光信号采集：请参考仪器说明书设置。
    
  • 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

• 扩增曲线：标准扩增曲线为S型。
  Ct值落在20～30之间时，定量分析最准确；
  Ct值小于10，需要将稀释模板后，重新进行实验；
  Ct值介于30～35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；
  Ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。
  
• 熔解曲线：
  熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。
  熔解曲线出现双峰，需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。
  如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。
  如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。

• 推荐引物长度25bp左右。扩增产物长度150bp为佳，可以在100bp～300bp内选择。
  
• 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃～65℃为佳。
  
• 引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。
  
• 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。
  
• 引物特异性需要用NCBIBLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。
  
• 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

• High Rox适用机型：ABI5700,7000,7300,7700,7900HTFast,StepOne,StepOne Plus;
  
• Low Rox适用机型：ABI 7500,7500 Fast,ViiA7,QuantStudio 3 and 5,QuantStudio6,7,12k Flex;Stratagene MX3000P,MX3005P,MX4000P;
  
• 不需要Rox校正的仪器型号：
  Bio-Rad CFX96,CFX384,iCycler iQ,iQ5,MyiQ,MiniOpticon,Opticon,Opticon 2,Chromo4;
  Eppendorf Mastercycler ep realplex,realplex 2 s;Qiagen Corbett Rotor-Gene Q,Rotor-Gene 3000,Rotor-Gene 6000;
  RocheApplied Science LightCycler 480,LightCycler 2.0;Lightcycler96;Thermo Scientific PikoReal Cycler;
  Cepheid SmartCycler;Illumina Eco qPCR.