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本制品是2×实时定量PCR扩增的预混液，具有高灵敏度和高特异性的特点，同时，定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。核心组分Hiper miRNA Taq DNA聚合酶采用抗体法热启动，再配以优化的Buffer，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增。另外，预混液体系中添加了ROX Reference Dye，能够适用于不同qPCR仪器，配置反应体系时只需加入引物和模板即可进行扩增。

• 推荐与cDNA第一链合成试剂盒(去除gDNA)配套使用。
  
• 2×Mix组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 配制反应体系：
  

  成分	用量
  2×Hiper Universal microRNA SYBR qPCR Mix	10μL
  Forward Primer(10μM)	0.5μL
  Reverse Primer(10μM)	0.5μL
  模板cDNA	x μL
  ddH2O	至10μL

  • 使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
    
  • 引物浓度：通常引物终浓度为0.25μM，也可以根据情况在0.1～1.0μM之间进行调整。
    
  • 模板浓度：如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
    
  • 模板稀释：cDNA原液建议5～10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的Ct值在20～30个循环为好。
    
  • 反应体系：推荐使用20μL体系反应，以确保目的基因扩增的有效性和重复性。
    
  • 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
• 设置反应程序：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	95℃	5min	1
  变性	95℃	10sec	40
  退火/延伸	60℃	30sec

  • 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。
    
  • 荧光信号的采集：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：
    20sec：Applied Biosystems 7700,7900HT,7500 Fast
    31sec：Applied Biosystems 7300
    32sec：Applied Biosystems 7500
    30sec：BIO-Rad CFX 96
    
  • 熔解曲线：仪器类型不同，熔解曲线采集程序不同，使用程序默认的熔解程序即可。

• 扩增曲线：标准扩增曲线为S型。
  Ct值落在20～32之间时，定量分析比较准确；
  Ct值小于10，需要将稀释模板后，重新进行实验；
  Ct值介于30～35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；
  Ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。
  
• 熔解曲线：
  熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。
  若熔解曲线出现双峰的情况，可以通过DNA琼脂糖凝胶电泳进一步判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。
  如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。
  如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。