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microRNA是一类被广泛关注的非编码RNA，长度为22nt左右，对植物和动物的基因表达有着非常重要的调控作用。本试剂盒采用SYBR Green I嵌合荧光法的原理进行miRNA荧光定量检测。本制品中的2×Hiper miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix是专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。DNA Polymerase采用化学修饰的热启动聚合酶，配合特殊的Buffer体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内进行准确定量。本制品必须与本公司的microRNA第一链cDNA合成试剂盒(加A法)配套使用，以获得最终的实验结果。

• 无核酸酶污染的枪头及离心管。
  
• PCR上游引物(Forward Primer)。
  
  • Forward Primer设计原则：通常以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T。Tm值建议在65℃左右。可适当在引物的5’端添加若干个G或C碱基以增加Tm值，也可适当在5'或3'端去掉若干碱基以减少Tm值，注意避免引入二级结构。

• 使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
  
• 实验时，请尽量使用无污染的耗材，避免污染。
  
• 本制品避免反复冻融，配制时应避免强光照射。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 配制SYBR qPCR反应体系：
  
  • 将试剂放置室温下融化，使用前上下颠倒，轻轻混匀，并轻微离心后使用，避免起泡。
    
  • 将试剂置于冰上，按照下表配制试剂。RNase-free H2O可替换为其他用于分子生物学实验的无核酸酶水。
    
    • 没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
  • 荧光定量PCR体系配制
    

    成分	20μL体系	50μL体系	终浓度
    2×Hiper miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix	10μL	25μL	1×
    Forward Primer(自备)	X	X	400 nM
    Reverse Primer (10μM)	0.8μL	2μL	400 nM
    cDNA	X	X	-
    RNase-free H2O	至20μL	至50μL	-

    
    
    • miRNA第一链cDNA的加入量不要超过qRT-PCR体积的1/10。高浓度cDNA易导致非特异扩增，可对cDNA适当稀释10～1000倍。
      
    • Reverse Primer (10μM)来源于microRNA第一链cDNA合成试剂盒(加A法)。由于的保密性，miRNA加A法反转录后，cDNA下游引物序列不同厂商之间存在差异，建议使用microRNA第一链cDNA合成试剂盒(加A法)，以保证最终的实验结果。
• 设置PCR反应程序：
  可参考以下两个程序进行定量PCR反应。
  

  两步法荧光定量PCR常规扩增程序一：	两步法荧光定量PCR常规扩增程序二：
  步骤 温度 时间 循环数 预变性 95℃ 10min 1 变性 95℃ 15sec 35～40 退火/延伸 60℃ 20sec	步骤 温度 时间 循环数 预变性 95℃ 10sec 1 变性 95℃ 5sec 40 退火/延伸 60℃ 20sec

  • 退火/延伸温度和时间可根据实验要求适当调整。
    
  • 常规程序与快速程序根据实验仪器选择，例如：ABI QuantStudio 5等仪器可以进行快速程序设置，Bio-Rad CFX96等仪器不可设置快速程序，需要进行常规程序设置。