产品目录

本制品是一款可直接对全血样本进行PCR扩增而无需进行DNA纯化或样本预处理的试剂盒，兼容含EDTA、肝素、柠檬酸盐等常规抗凝剂的新鲜血液、冷藏(冻)血液及Whatman903和FTA商用干血渍。试剂盒中含有经过经基因工程改造的DNA Polymerase组合，具有保真性高、对PCR抑制剂耐受性强的特点，2×Hiper Blood Advanced PCR Buffer中添加强力延伸因子、扩增增强因子以及优化的缓冲体系，能够在快速延伸条件下高效扩增8kb的基因组片段，对于2kb以下的片段，设置3～5sec/kb延伸时间即可完成扩增，从而大幅缩短血液样本的鉴定及检测时间。

本试剂盒中提供的引物预混液Positive control primer mix(10μM each)能够从哺乳动物和大多数脊椎动物的sox21基因上游保守序列中扩增出长度237bp的片段，可作为阳性对照使用。

• 推荐血液模板使用量为反应总体积的10%，即50μL反应体系中加入5μL全血作为模板，注意避免吸取血液凝块。
  
• 延伸时间10sec/kb可扩增8kb以下大部分目的片段，3～5sec/kb即可扩增大部分2kb以下片段。若扩增效率较低，可适当延长时间至30sec/kb。
  
• PCR反应结束后，推荐将反应产物于4000rpm (1000×g)离心1～3min以沉淀血细胞碎片，取上清进行下游分析。
  
• 本制品不可直接用于医疗诊断。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

• 配制PCR反应体系：
  

  成分	用量
  ddH2O	至50μL
  2×Hiper Blood Advanced PCR Buffer	25μL
  Forward Primer (10μM)	2μL
  Reverse Primer (10μM)	2μL
  Hiper Advanced High-Fidelity DNA Polymerase Mix	1μL
  血液样本	X μL

  
  
  • 使用前请充分混匀各组分。
    
  • 推荐每条引物的使用终浓度为0.4μM，过高会导致非特异性扩增。
    
  • 最佳全血模板浓度范围为0.5%～20%，推荐使用量为10%作为初始尝试条件，即50μL反应体系中加入5μL全血作为模板，注意避免吸取血液凝块。对于贮存在Whatman滤纸卡上的干血渍，则可取约1mm2带血渍的圆纸片，无需进行预处理，直接放入PCR反应液中即可进行扩增。
• 设置PCR反应条件：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	95℃	5min	1
  变性	95℃	15sec	30～35
  退火	60℃	15sec
  延伸	72℃	3～10sec/kb
  终延伸	72℃	5min	1

  • 退火温度为通用Tm值或低于引物Tm值1～2℃。如果扩增产物特异性较差，可以建立退火温度梯度以寻找最佳退火条件。
    
  • 延伸时间10sec/kb可扩增8kb以下大部分目的片段，3～5sec/kb即可扩增大部分2kb以下片段。若扩增效率较低，可适当延长时间至20～30sec/kb，不应超过60sec/kb。
• PCR产物分析：PCR反应结束后，推荐将反应产物于4000rpm (1000×g)离心1～3min以沉淀血细胞碎片，取上清进行下游分析。该步骤可消除全血中多种残留成分对电泳检测的干扰，对使用高浓度血液作为模板的PCR产物尤为必要。通常，5μL/50μL (10%)反应产物可取30～35μL上清，3μL/50μL (5%)反应产物可取40～45μL上清。若需对PCR产物进行其它分析，例如酶切等，应将产物稀释2～4倍以降低反应中的盐及其它抑制剂对反应的干扰。
  
• 对照反应：本试剂盒提供引物预混液Positive Control Primer Mix (10μM each)用于阳性对照反应。可从哺乳动物及其他许多脊椎动物的基因组sox 21基因上游序列中扩增出237bp的片段，该扩增区是一段高度保守的非编码区。
  Primer F:5'- AGCCCTTGGGGASTTGAATTGCTG -3'
  Primer R:5'- GCACTCCAGAGGACAGCRGTGTCAATA -3'