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本试剂盒可直接快速地对小鼠组织(如鼠尾、鼠耳、鼠趾等)样本进行PCR扩增，具有极强的样本兼容性。本试剂盒配备了强力的裂解缓冲液，可以快速裂解样品，释放基因组DNA。裂解产物可以直接加入到PCR反应体系中，无需精提纯化，操作方便。此外，本试剂盒对样品投入量要求低，2～5mm2鼠耳或肝脏、1～5mm鼠尾、1～2个脚趾均可进行实验。

本试剂盒提供的2×Hiper Tissue Direct PCR Mix为2倍浓度的热启动PCR反应液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化操作过程，降低污染几率。本试剂盒可用于转基因鉴定、小鼠基因分型等。

• Lysis solution为裂解液，请戴手套操作，置于2～8℃保存，有效期1年。若长时间多次使用，请分装后储存，避免交叉污染。
  
• 2×Hiper Tissue Direct PCR Mix：包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、4mM Mg²⁺、PCR反应增强剂、稳定剂等。
• Proteinase K和2×Hiper Tissue Direct PCR Mix置于-20℃保存，避免反复冻融。有效期1年。

• 为了避免样本间交叉污染，每次取样后都需要将取样器材的刃口或与样本直接接触的部位浸入2%次氯酸钠溶液或75%酒精中，反复洗刷数次进行清洗，然后用干净的纸巾擦干残余液体后再进行使用。为了试验方便，也可准备多个取样器材，在使用完后进行统一清洗，确保每一单独样本均使用的是无污染的取样器材。
  
• 建议使用新鲜采取的动物组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。
  
• 建议扩增片段长度6kb以内，以便扩增效率最佳。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途。

• 样品基因组DNA释放：
  
  • 剪取2～5mm2鼠耳或肝脏组织，或1～5mm鼠尾、或1～2个脚趾，置于1.5mL离心管中；
    
  • 在上述离心管中加入200μL Lysis solution和10μL Proteinase K，轻轻涡旋混匀，使得样品完全被浸润，短暂离心；
    
  • 在恒温孵育仪中70℃孵育10min；
    
  • 孵育完成后，将样品置于95℃或者沸水浴中加热5min灭活Proteinase K；
    
  • 将裂解产物涡旋振荡充分混匀后，12000rpm (13400×g)离心10min；
    
  • 将上清转移至新的离心管，-20℃保存不超过48小时或直接取上清用于后续PCR扩增。
    
    • 组织应尽量剪碎，以便裂解反应更顺利进行。
      
    • 70℃孵育，一般10min即可满足多数PCR需求。若需要的DNA量较大或样品较难裂解，可将时间延长至20～30min。组织块不需完全裂解，残余的部分在后续离心步骤中可被除去。
• PCR反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  2×Hiper Tissue Direct PCR Mix	25μL	1×
  Forward Primer (10μM)	2μL	0.4μM
  Reverse Primer (10μM)	2μL	0.4μM
  裂解产物	1～5μL	-
  ddH2O	至50μL -

  • 模板使用量：50μL体系建议初步采用2μL上清液作为模板起始投入量，若产物量较少，可适当增加模板投入量；
    
  • 引物终浓度：0.2～0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可在0.1～0.5μM范围内调整引物浓度；
    
  • 反应体系：推荐使用50μL，也可根据使用习惯调整体系体积大小；
    
  • 体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。
• PCR反应程序：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	95℃	5min	1
  变性	95℃	15sec	35
  退火	60℃	15sec
  延伸	72℃	3～10sec/kb
  终延伸	72℃	5min	1

  • 退火温度：请参考引物的理论Tm值，退火温度可设置低于引物理论值2～5℃。
    
  • 延伸时间：1～4kb用3～10s/kb，4kb以上用20s/kb。
    
  • 扩增循环数：35个循环已可以扩增足量产物。
    
  • 电泳上样：取5～7μL扩增产物上样即可。
• 对照反应：在PCR结果分析时，不管是阳性结果或阴性结果，如果没有对照反应，都不能确定结果是否可靠。为了便于后续实验结果的分析，建议在进行PCR时，设置阳性(小鼠基因组DNA)和阴性(通常为生理盐水)PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。