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本试剂盒包含组织快速裂解试剂和扩增试剂，可直接对小鼠组织(如鼠尾、鼠耳、鼠趾、肝脏、肾脏等)样本进行裂解，快速释放基因组DNA，还可兼容血液、细胞悬浮液等样本，裂解产物的上清液可直接加入到PCR反应体系中，无需精提纯化，操作方便。此外，本试剂盒对样品投入量要求低，2～5mm²鼠耳或肝脏、1～5mm鼠尾、1～2个脚趾均可进行实验。

本试剂盒提供的2×Hiper Tissue Direct PCR Mix(With Dye)为2倍浓度的PCR反应液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化操作过程，降低污染几率，可广泛扩增10kb及以内的片段。本试剂盒可用于转基因鉴定、小鼠基因分型等。

• 未开封状态下，-25~-15℃保存，有效期1年。
  
• 开封后Lysis Solution、Termination Solution置于4℃保存，有效期1年。若长时间多次使用，请分装后储存，避免交叉污染。
  
• 开封后2×Hiper Tissue Direct PCR Mix(With Dye)置于-25~-15℃保存，避免反复冻融，有效期1年。

• 样品基因组DNA释放：
  
  • 剪取2～5mm²鼠耳或肝脏组织，或1～5mm鼠尾、或1～2个脚趾，置于200μL的PCR管中；
    
  • 在上述离心管中加入50μL Lysis Solution，涡旋混匀，使得样品完全被浸润，短暂离心；
    
  • 在恒温孵育仪或PCR仪中60℃孵育10～20min或95℃孵育3～5min；
    
  • 孵育完成后，向上述PCR管中加入50μL Termination Solution；
    
  • 将裂解产物涡旋振荡充分混匀后，12000rpm(13400×g)离心5min；
    
  • 将上清转移至新的离心管中，用于后续PCR扩增或储存备用。
    
  • 相关操作注意事项：
    
    • 组织应尽量剪碎，以便裂解反应更顺利进行；
      
    • 组织样本在裂解前应优先保证新鲜度，建议使用活体解剖后即刻采集的新鲜样本。若无法实现样本的即时处理，可将组织单次分装后，于-80℃超低温冰箱内冻存，避免反复冻融；
      
    • 裂解后的上清液可4℃储存一个月，若需要长期储存，须在-20℃条件下；
      
    • 一般95℃ 3min可以裂解大部分小鼠组织，若样本较难裂解，可以适当延长时间，若需要低温裂解推荐60℃ 15～20min；
      
    • 可根据实验条件需求，扩大或减少样本用量，并等比例增加A组分和B组分的用量；
      
    • 细胞或全血样本，可不经裂解，直接进行扩增，但是要延长预变性时间。
• PCR扩增：
  
  • 将2×Hiper Tissue Direct PCR Mix(With Dye)置于冰上融化后，轻轻震荡混匀后备用；
    
  • 冰上配制下表中的PCR扩增反应液。配制完成后充分混匀离心；
    
  • 若模板为全血样本，建议先添加其他组分并混匀后，再添加血液模板，加完模板后，无需混匀，可直接上机；
    
    表1.PCR扩增反应体系

    成分	用量
    裂解产物(体积不超过PCR反应体系的10%)	2～5μL
    正向引物(10μM)	2μL
    反向引物(10μM)	2μL
    2×Hiper Tissue Direct PCR Mix(With Dye)	25μL
    ddH2O	至50μL

    • PCR反应体系中引物终浓度范围0.4～1μM，引物终浓度过低，会影响扩增效果，若扩增效果不理想，可适当提高引物添加量，提升检出率。
      
    • 裂解产物可能存在较多的PCR抑制物，若扩增结果不理想，可减少模板添加体积，或适度稀释后再添加。
  • 将PCR管转移到PCR仪根据表2进行片段扩增；
    
  • 推荐PCR扩增程序：
    
    表2.PCR扩增反应程序

    步骤	温度	时间	循环数
    预变性	98℃	30sec/3min	1
    变性	98℃	10sec	30～35
    退火	60℃	5sec
    延伸	72℃	5～10sec/kb
    终延伸	72℃	2min	1
    保持	4℃	hold	－

    • 当模板是组织裂解液时可选用98℃ 30sec进行预变性，当模板是未经裂解的细胞悬液、全血时，预变性条件需改为98℃ 3min。
      
    • 退火温度推荐使用60℃，也可根据需要，设立温度梯度去摸索引物退火的最适温度。推荐退火时间为5sec，可以在5～20sec内调节。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈弥散状。
      
    • 延伸温度和时间：10kb以上长片段或较高GC片段扩增，推荐使用68℃，10kb及以下片段且GC在40%～60%的片段扩增，可以尝试72℃延伸。当扩增效果不理想时，延伸速率根据实际结果可在5～10sec/kb之间进行调整，扩增片段＜5kb时，延伸速率可选5sec/kb，当扩增片段≥5kb时，延伸速率可选10sec/kb。
• 扩增产物质检：取2～6μL扩增产物，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，检测是否扩增出正确条带。

• 样品基因组DNA释放：
  
  • 剪取2mm鼠尾置于200 μLPCR管中；
    
  • 在上述离心管中立即加入50μL Lysis Solution，轻轻涡旋混匀，使得样品完全被浸润，随后短暂离心；
    
  • 在PCR仪中95℃孵育3min；
    
  • 孵育完成后，向样品中加入50μL Termination Solution，涡旋混匀；
    
  • 将裂解产物涡旋振荡充分混匀后，12000rpm(13400×g)离心10min；
    
  • 取上清作为模板进行后续PCR扩增。
• 多重引物扩增：
  
  • 将多重的14条引物统一稀释至10μM，按下表比例进行混合：
    

    引物长度	Mus-500bp	Mus-750bp	Mus-1K	Mus-2K	Mus-3K	Mus-4K	Mus-5K
    正向引物(μL)	2.5	2	4	2	5	2.5	7
    反向引物(μL)	2.5	2	4	2	5	2.5	7

    
    
  • PCR反应体系：
    

    成分	用量
    2×Hiper Tissue Direct PCR Mix(With Dye)	12.5μL
    多重引物Mix	3.5μL
    裂解产物	1μL
    ddH2O	至25μL

    
    
  • PCR扩增程序：
    

    步骤	温度	时间	循环数
    预变性	98℃	30sec	1
    变性	98℃	10sec	30
    退火	60℃	5sec
    延伸	72℃	30sec
    终延伸	72℃	2min	1
    保持	4℃	hold	－

    
    
  • 产物电泳检测：0.5%琼脂糖凝胶，4μL反应液上样，120V电泳60min，电泳条带如下。
    
    

• 电泳条带弱(扩增产量低)
  
  • 引物：优化引物设计；
    
  • 退火温度：设置退火温度梯度，找到合适的退火温度；
    
  • 引物浓度：适当提高引物浓度；
    
  • 延伸时间：适当增加延伸时间至10sec/kb；
    
  • 循环数：增加循环数至36～40个循环；
    
  • 模板量不足：样本裂解不彻底导致DNA释放量少，可适当延长裂解时间至20min或提高裂解温度至95℃。
• 有杂带或弥散条带
  
  • 引物设计问题：引物错配导致扩增特异性差，需重新设计引物，可以先用精提模板扩增，验证引物设计的合理性；
    
  • 退火温度：尝试提高退火温度并设置退火温度梯度；
    
  • 引物浓度：适当降低引物浓度；
    
  • 循环数：减少循环数至25～30个循环；
    
  • 模板降解：更换高质量模板。
• 产物堵胶孔
  
  • 清洁实验环境，避免气溶胶污染；
    
  • 模板使用量：降低模板使用量；
    
  • 循环数：减少循环数至25～30个循环；
    
  • 退火温度：设置退火温度梯度，摸索最佳退火温度。