产品货号：
SY0833
中文名称：
cDNA第一链合成试剂盒(去除gDNA)
英文名称：
Histan III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)
产品规格：
10T|100T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是含有gDNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于Histan III Reverse Transcriptase而开发。该酶cDNA合成速度快，且热稳定性大幅度提高，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Histan III Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可合成长达19.8kb的cDNA。
该试剂盒包含gDNA digester Mix，可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物：Random Primers N6和oligo (dT)18，用户可根据需要，选择Random Primers N6，Oligo (dT)18或Gene Specific Primers作为逆转录引物，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。
| 组分 | 10T | 100T |
| RNase-free H2O | 1mL | 2×1mL |
| 5×gDNA Digester Mix | 30μL | 300μL |
| 10×Histan III Super Buffer1 | 20μL | 200μL |
| Histan III RT Enzyme Mix2 | 10μL | 100μL |
| Random Primers N6 (50μM) | 10μL | 100μL |
| Oligo (dT)18 (50μM) | 10μL | 100μL |
保存：-20℃，有效期1年。
- 10×Histan III Super Buffer包含gDNA digester抑制剂和dNTPs。
- Histan III RT Enzyme Mix包含RNase inhibitor。
- 反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染。
- 建议RNA是溶于水而不是TE中，因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应。
- 5×gDNA digester Mix、10×Histan III Super Buffer、Histan III RT Enzyme Mix使用前请轻轻上下颠倒混匀，并小心离心至底部。吸取液体时请使用量程合适的移液器，枪头不要插入液面下过深。
- qPCR实验推荐基因组去除步骤，保证结果更加真实可靠。
- 本制品仅作科研用途！
- 如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)18，与真核生物mRNA的3' Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
- 原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。
- Random Primers N6适用性较广，适用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。
一、若实验需要去除残留基因组DNA
- gDNA消化
在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2min。
注*：若后续实验为qPCR，Total RNA投入量为10pg～1μg；mRNA的投入量为10pg～100ng。若基因的表达丰度很低，最多可投入5μg Total RNA或500ng mRNA。成分 用量 RNase-free H2O 至15μL 5×gDNA Digester Mix 3μL 模板 Total RNA 10pg～5μg* mRNA 10pg～500ng* - 逆转录反应体系配制
注：成分 使用量 上一步的反应液 15μL 10×Histan III Super Buffer 2μL Histan III RT Enzyme Mix 1μL 引物 Random Primers N6(50μM) 1μL Oligo (dT)18(50μM) 1μL Gene Specific Primer (2μM) 1μL RNase-free H2O 至20μL
① 逆转录引物：后续进行qPCR时，推荐Random Primers N6与Oligo (dT)18 1:1混合使用。
② 建议先加入10×Histan III Super Buffer混匀后再添加逆转录引物，以保证完全抑制gDNA digester的活性。
③ 体系配制完成后，请用移液器轻轻吹打混匀。 - 逆转录程序
- 逆转录标准程序设置
注：温度 时间 25℃ 5min 55℃ 15min 85℃ 5min
① 逆转录温度：推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃。
② 逆转录时间：后续进行qPCR时，推荐15min；若后续用于PCR时，推荐30min～60min。 - 逆转录快速程序设置
温度 时间 55℃ 15min 85℃ 5sec
注：逆转录快速程序适用于中低GC含量（≤55%）或者简单模板后续的荧光定量实验。
- 逆转录标准程序设置
- 逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。
二、若实验无需去除基因组DNA
- RNA模板变性
在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。65℃孵育5min，迅速置于冰上，并静置3min。成分 用量 RNase-free H2O 至17μL 模板 Total RNA 10pg～5μg mRNA 10pg～500ng 引物 Random Primers N6 (50μM) 1μL Oligo (dT)18 (50μM) 1μL Gene Specific Primer (2μM) 1μL - 逆转录反应体系配制
成分 用量 上一步的反应液 17μL 10×Histan III Super Buffer 2μL Histan III RT Enzyme Mix 1μL - 参照上述程序进行后续上机实验。
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