产品货号:
SY0824
中文名称:
小鼠组织直接PCR试剂盒
英文名称:
Mouse Tissue Direct PCR Kit
产品规格:
50T|200T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒可直接快速地对小鼠组织(如鼠尾、鼠耳、鼠趾、肌肉等)样本进行PCR扩增,具有极强的样本兼容性。本试剂盒配备了强力的裂解缓冲液,可以快速裂解样品,释放基因组DNA。裂解液可以直接加入到PCR反应体系中,无需精提纯化,操作方便。此外,本试剂盒对样品投入量要求低,5mg小鼠组织或1~5mm鼠尾即可进行实验。本试剂盒可用于转基因鉴定、小鼠基因分型等。
本试剂盒提供的2×Mouse Direct PCR Mix为2倍浓度的热启动PCR反应液,包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分,大大简化操作过程,降低污染几率。
组分 | 50T | 200T | |
包装一 | Buffer ML | 1mL×5 | 20mL |
包装二 | Buffer MT | 0.6mL | 1.25mL×2 |
2×Mouse Direct PCR Mix | 500μL | 1mL×2 |
保存:包装一置于4℃,包装二置于-20℃,避免反复冻融,有效期1年。
- Buffer ML为裂解缓冲液,包含了强力蛋白变性剂,请戴手套操作。
- Buffer MT为终止缓冲液,用以终止Buffer ML的裂解功能。
- 2×Mouse Direct PCR Mix:包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂、稳定剂和电泳指示染料等。
- 为了避免样本间交叉污染,每次取样后都需要将取样器材的刃口或与样本直接接触的部位浸入2%次氯酸钠溶液中,反复洗刷数次,然后用干净的纸巾擦干残余液体后再进行使用。为了试验方便,也可准备多个取样器材,在使用完后进行统一清洗,确保每一单独样本均使用的是无污染的取样器材。
- 建议使用新鲜的动物组织,若为长期冷冻组织,应尽量避免反复冻融,否则会导致模板的降解,影响PCR效率。
- 建议扩增片段长度1kb以内,以便扩增效率最佳。
- 在PCR结果分析时,不管是阳性结果或阴性结果,如果没有对照反应,都不能确定结果是否可靠。为了便于后续实验结果的分析,建议在进行PCR时,设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。
- 样品基因组DNA释放
- 剪取5~10mg动物组织或1~5mm鼠尾,置于1.5mL离心管中;
- 在上述离心管中加入90μL Buffer ML,轻轻涡旋使得样品完全被裂解液浸润,短暂离心;
- 在恒温孵育仪中设置95℃孵育15min;
- 加入10μL Buffer MT,轻弹混匀,终止裂解;
- 选做步骤:12000rpm离心2min;
- 将上清转移至新的离心管,4℃或-20℃保存或直接取上清用于后续PCR扩增。
- 组织应尽量剪碎,以便裂解反应更顺利进行。
- 5℃孵育,一般15min即可满足多数PCR需求。若需要的DNA量较大或样品较难裂解,可将时间延长至30min。组织块不需完全裂解,残余的部分在后续离心步骤中可被除去。
- 剪取5~10mg动物组织或1~5mm鼠尾,置于1.5mL离心管中;
- PCR反应鉴定—PCR反应体系
注:各组分使用前应充分混匀。成分 用量 终浓度 2×Mouse Direct PCR Mix 10μL 1× Forward Primer (10μM) 0.5μL 0.2~0.4μM Reverse Primer (10μM) 0.5μL 0.2~0.4μM 裂解产物(DNA模板) 1μL - ddH2O 至20μL - - 模板使用量:建议按1~10%总体系量取用模板,20μL体系建议采用1μL上清液作为模板;
- 引物终浓度:0.2~0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时,可在0.1~0.5μM范围内调整引物浓度;
- 反应体系:推荐使用20μL,也可根据使用习惯调整体系体积大小;
- 体系配制:配制好PCR反应体系,置于涡旋仪上涡旋混匀,瞬时离心将反应液集于管底。
- 模板使用量:建议按1~10%总体系量取用模板,20μL体系建议采用1μL上清液作为模板;
- PCR反应鉴定—PCR反应条件
注:步骤 温度 时间 循环数 预变性 94℃ 5min 1 变性 94℃ 10sec 35 退火 60℃ 20sec 延伸 72℃ 30sec/kb 终延伸 72℃ 5min 1 - 退火温度:请参考引物的理论Tm值,退火温度可设置低于引物理论值2~5℃。
- 延伸时间:请按30sec/kb设定。
- 扩增循环数:35个循环已可以扩增足量产物。
- 电泳上样:取3~5μL扩增产物上样即可。
- 退火温度:请参考引物的理论Tm值,退火温度可设置低于引物理论值2~5℃。
常见问题 | 可能原因 | 解决方法 |
阳性对照、待测样本均无条带。 | PCR反应体系或反应条件不合适。 | 使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。 |
PCR试剂保存不当失去活性。 | 2×Mouse Direct PCR Mix应保存于-20℃,使用时避免反复冻融。若使用频繁,可在4℃短时间存放。 | |
引物设计问题。 | 尝试重新设计引物进行检查。 | |
阳性对照有目的条带,待测样本无条带或条带弱。 | 不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。 | 使用新鲜的试剂。 |
加入组织裂解液过量。 | 增大反应体系,或减少裂解液的用量。 | |
样本裂解混合液保存不当或保存时间过久,DNA基因组已经降解。 | 裂解混合液液可在4℃保存2~3天,尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。 | |
模板加入量不适合。 | 在反应体系1~10%范围内优化模板加入量。 | |
PCR循环数不足。 | 增加PCR的循环数,推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂,PCR反应要比用纯化的DNA模板多5~10个循环为佳。 | |
非特异性扩增 | PCR退火温度太低,循环数、引物浓度或模板浓度太高。 | 增加PCR退火温度,降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。 |
PCR引物错配。 | 重新设计PCR引物。 | |
配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。 | PCR反应体系的配制在低温下进行,配制完成后尽快进行PCR扩增反应。 | |
阴性对照出现目的条带 | 操作工具或试剂污染。 | 实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 |
样本间交叉污染。 | 每个取样器只对一个样本使用;或取完一个样本后,将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中,反复涮洗,然后用干净的纸巾擦干残液。 |
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