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本产品是一款可直接对不同动物组织进行PCR扩增的试剂盒，适应性广、稳定性强、操作简易。可用于动物基因扩增检测、转基因动物基因型鉴定等。

本试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系，可以快速的裂解多种动物组织样品并释放出基因组DNA，如昆虫足翅、鼠尾、鼠趾、动物皮肤和内脏等。裂解产物可以用于DNA提取纯化、也可以直接用于PCR反应、也可以在-20℃或以下温度条件下长期保存备用。

本试剂盒中提供的2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye)具有很强的扩增兼容性，不需要额外采用纯化提取试剂去除裂解产物中的各种残骸杂质，能直接以待测样品裂解液为模板，进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化扩增步骤的操作过程，降低污染机率。

组分	50T	200T	说明
Lysis Buffer	10mL	2×20mL	动物组织裂解缓冲液，与Proteases配合使用于动物组织裂解。建议保存于2～8℃。
Proteases	100μL	400μL	动物组织裂解剂，使用时请勿长久开盖，建议保存于-20℃，避免反复冻融。
2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye)	200μL	2×1mL	包含PCR扩增所需要的热启动Taq DNA聚合酶、dNTP和Mg2+等；已混有溴酚蓝染料作为电泳指示剂，PCR产物可以直接进行电泳。建议保存于-20℃，避免反复冻融。
5×PCR Enhancer	500μL	800μL	高GC含量扩增（如大于65%）时推荐使用。建议保存于-20℃，避免反复冻融。

• 样本裂解
  
  • 在离心管中加入200μL Lysis Buffer和2μL Proteases，轻轻涡旋混匀。
    
  • 取约10mg（长度2mm左右）动物组织，置于上述离心管中，轻轻涡旋混匀。
    注：建议使用新鲜采取的动物组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。
    
  • 55℃孵育5～30min，然后95℃处理5min。
    
  • 12000rpm离心2min。
    
  • 将上清转移至新的离心管，-20℃保存或直接用于PCR扩增。
    注：
    
    • Lysis Buffer与Proteases混合后尽快使用，不宜长期保存；大量样本操作时，可以将Lysis Buffer与Proteases按100μL:1μL的比例混匀备用。
      
    • 组织应取少量并尽量剪碎，以便裂解反应更顺利进行。各组织推荐使用量：
      

      样本类型	用量
      鼠尾	长度2～4mm
      鼠趾	1～4个
      鼠脏器、脑	直径2～4mm
      斑马鱼、线虫、果蝇等昆虫组织	1～4个
      细胞数量	105～108个

      
      斑马鱼、线虫、果蝇等较小样本的组织，可适当减少Lysis Buffer至50～100μL。昆虫等外壳坚硬的样本，建议剪碎样本并增加Proteases至4μL。
      
    • 55℃孵育，一般5min即可满足多数PCR需求，如鼠尾、鼠耳等组织；若需要的DNA量较大或样品较难裂解，可将时间延长至30min或更久；裂解时间可在5～30min之间调整，组织块不需完全裂解，残余的部分在后续离心步骤中可被除去。
  
  
• 配制反应体系
  按下表配制PCR反应体系，各组分使用前应充分混匀：
  

  成分	用量	终浓度
  2×Tissue Direct PCR Mix（With Dye）	10μL	1×
  Forward Primer（10μM）	0.5μL	0.25μM
  Reverse Primer（10μM）	0.5μL	0.25μM
  裂解产物（DNA模板）	2μL	-
  无菌超纯水	至20μL	-

  
  注：
  
  • 模板使用量：建议总体系的5～20%之间，避免超过总体系的20%。
    
  • 引物终浓度：反应性能较差时，推荐在0.1～0.5μM范围内调整引物浓度。
    
  • 反应体系：推荐使用20μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
    
  • 体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。
    
  • 对照反应：建议进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。
  
  
• 设置反应程序
  

  过程	温度	时间	循环数
  预变性	94℃	5min	1
  变性	94℃	10sec	35
  退火	60℃	20sec
  延伸	72℃	20sec
  终延伸	72℃	5min	1

  
  注：退火温度请参考引物的理论Tm值，退火温度可设置低于引物理论值5℃，或通过梯度PCR确定最佳温度。

常见问题	可能原因	解决方法
阳性对照、待测样本均无条带。	PCR反应体系或反应条件不合适。	使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。
	PCR试剂保存不当失去活性。	2×PCR Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。
	引物设计问题。	尝试重新设计引物进行检查。
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。	不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。	使用新鲜的试剂。
	加入组织裂解液过量。	增大反应体系，或减少裂解液的用量。
	样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。	裂解混合液可在4℃保存2～3天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。
	模板加入量不适合。	在反应体系5～20%范围内优化模板加入量。
	PCR循环数不足。	适当增加PCR的循环数，推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂，一般PCR反应要比用纯化的DNA模板多5～10个循环为佳。
非特异性扩增	PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。	提高PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。
	PCR引物错配。	重新设计PCR引物。
	配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。	PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。
阴性对照出现目的条带	操作工具或试剂污染。	实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
	样本间交叉污染。	每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。

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