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本试剂盒可直接对不同动物组织进行PCR扩增的试剂盒，适应性广、稳定性强、操作简易。本试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系，可以快速的裂解多种动物组织样品并释放出基因组DNA，如昆虫足翅、鼠尾、鼠趾、动物皮肤和内脏等。裂解产物可以用于DNA提取纯化、也可以直接用于PCR反应、也可以在-20℃或以下温度条件下长期保存备用。

本试剂盒中提供的2×Tissue Direct PCR Mix(With Dye)具有很强的扩增兼容性，不需要额外采用纯化提取试剂去除裂解产物中的各种残骸杂质，能直接以待测样品裂解液为模板，进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化扩增步骤的操作过程，降低污染机率。本试剂盒可用于动物基因扩增检测、转基因动物基因型鉴定等。

• Lysis Buffer为动物组织裂解缓冲液，建议保存于2～8℃。
  
• Proteases为动物组织裂解剂，使用时请勿长久开盖，建议保存于-25~-15℃，避免反复冻融。
  
  • Lysis Buffer和Proteases两种组分配合使用于动物组织裂解。
• 2×Tissue Direct PCR Mix(With Dye)包含PCR扩增所需要的热启动TaqDNA聚合酶、dNTP和Mg²⁺等；已混有溴酚蓝染料作为电泳指示剂，PCR产物可以直接进行电泳。建议保存于-25~-15℃，避免反复冻融。
  
• 5×PCR Enhancer建议用于高GC含量扩增(如大于65%)情况下。建议保存于-25~-15℃，避免反复冻融。

• 建议使用新鲜采取的动物组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途。

• 在离心管中加入200μL Lysis Buffer和2μL Proteases，轻轻涡旋混匀。
  
• 取约10mg(长度2mm左右)动物组织，置于上述离心管中，轻轻涡旋混匀。
  
• 55℃孵育5～30min，然后95℃处理5min。
  
• 12000rpm离心2min。
  
• 将上清转移至新的离心管，-20℃保存或直接用于PCR扩增。
  
  • Lysis Buffer与Proteases混合后尽快使用，不宜长期保存；大量样本操作时，可以将Lysis Buffer与Proteases按100μL:1μL的比例混匀备用。
    
  • 组织应取少量并尽量剪碎，以便裂解反应更顺利进行。各组织推荐使用量：鼠尾：长度2～4mm；鼠趾：1～4个；鼠脏器、脑：直径2～4mm；斑马鱼、线虫、果蝇等昆虫组织：1～4个；细胞数量:10⁵～10⁸个。斑马鱼、线虫、果蝇等较小样本的组织，可适当减少Lysis Buffer至50～100μL。昆虫等外壳坚硬的样本，建议剪碎样本并增加Proteases至4μL。
    
  • 55℃孵育，一般5min即可满足多数PCR需求，如鼠尾、鼠耳等组织；若需要的DNA量较大或样品较难裂解，可将时间延长至30min或更久；裂解时间可在5～30min之间调整，组织块不需完全裂解，残余的部分在后续离心步骤中可被除去。
• 推荐PCR反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  2×Tissue Direct PCR Mix(With Dye)	10μL	1×
  Forward Primer(10μM)	0.5	0.25μM
  Reverse Primer(10μM)	0.5	0.25μM
  裂解产物(DNA模板)	2	－
  无菌超纯水	至20μL	－

  • 各组分使用前应充分混匀。
    
  • 模板使用量：建议总体系的5～20%之间，避免超过总体系的20%。
    
  • 引物终浓度：反应性能较差时，推荐在0.1～0.5μM范围内调整引物浓度。
    
  • 反应体系：推荐使用20μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
    
  • 体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。
    
  • 对照反应：建议进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。
• 反应程序：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	94℃	5min	1
  变性	94℃	10sec	35
  退火	60℃	20sec
  延伸	72℃	20sec
  终延伸	72℃	5min	1

  • 退火温度：请参考引物的理论Tm值，退火温度可设置低于引物理论值5℃，或通过梯度PCR确定最佳温度。