产品货号：
SN0059
中文名称：
第一链cDNA合成试剂盒(防基因组DNA污染)
英文名称：
TarScript First-strand cDNA Synthesis kit(with dsDNase)
产品规格：
50T
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
简要说明：
产品特点：
适用范围：
产品组成：
保存：-20℃，有效期1年。
注意事项：
使用方法：
一、后续实验为PCR
二、后续实验为qPCR
常见问题：
相关搜索：第一链cDNA合成试剂盒(防基因组DNA污染)，反转录试剂盒，逆转录试剂盒
本制品是专为两步法RT-PCR第一步cDNA第一链合成配制的试剂盒，它包含从RNA模板到cDNA合成所需的所有试剂。本制品中包含的M-MLV III Reverse Transcriptase是新一代逆转录酶，该酶去除了RNase H活性，并大幅提高了热稳定性和逆转录效率，将最适反应温度提高为50℃，从而极大地提高了合成cDNA第一链时的特异性和长度（最长可达12kb），以及增强了对RNA复杂二级结构的耐受性。
产品特点：
- 热稳定性强：50℃反应，提高了RNA模板复杂二级结构的逆转录效率。
- 逆转录效率高：与市面上同类产品对比，本制品的逆转录效率更高。
- 快速去除基因组污染。
适用范围：
本制品适用于动物、植物及微生物RNA模板（总RNA或mRNA）的第一链cDNA合成反应，后续可用于PCR、qPCR、cDNA第二链的合成以及cDNA文库构建等实验。
产品组成：
| 组分 | 规格 |
| M-MLV III Reverse Transcriptase(200U/μL) | 50μL |
| 5×M-MLV III Buffer | 200μL |
| dsDNase | 50μL |
| 10×dsDNase Buffer | 50μL |
| DTT | 50μL |
| RNase Inhibitor (40U/μL) | 50μL |
| Oligo dT Primer (50μM) | 50μL |
| Random Primer (50μM) | 50μL |
| Nuclease-Free Water | 1.0mL |
保存：-20℃，有效期1年。
注意事项：
- 若后续实验为PCR，模版RNA为真核生物mRNA，一般情况下首选Oligo dT Primer，与真核生物mRNA的3' Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA；基因特异性引物的特异性最高，若基因特异性引物逆转录效率较差时也可使用Oligo dT Primer；当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物RNA，推荐使用Random Primer进行逆转录。
- 根据实验需求确定是否需要进行基因组去除步骤，若不进行基因组去除步骤，可直接进行逆转录反应，空余体积用Nuclease-Free Water补足即可。
- 建议将逆转录得到的cDNA原液稀释5～10倍后再作为qPCR反应的模板，若直接使用cDNA原液作为模板，建议cDNA原液体积不超过qPCR反应体积的1/10。
- 逆转录产物建议立即用于qPCR反应或保存于-20℃后尽快使用。若需要长期保存，建议于-80℃保存，避免反复冻融。
使用方法：
一、后续实验为PCR
- RNA模板变性（≥3kb cDNA合成需进行此步骤，可使模板RNA变性，提高逆转录效率）
- 在RNase-Free离心管中于冰上配制如下反应液：
成分 用量 RNA模板 50ng～1μg Oligo dT引物(50μM)或随机引物(50μM)或基因特异性引物(2μM) 1.0μL 无核酸酶水 至8μL 推荐使用试剂盒提取的RNA作为模板。 - 用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心后65℃孵育5min，冰上迅速冷却。
- 在RNase-Free离心管中于冰上配制如下反应液：
- 基因组DNA去除
- 在RNase-Free离心管中于冰上配制如下反应液：
成分 用量 上述反应液 8μL dsDNase 1.0μL 10×dsDNase Buffer 1.0μL - 用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心后42℃孵育2min，冰上迅速冷却。
- 在RNase-Free离心管中于冰上配制如下反应液：
- 逆转录反应
- 在上述反应管中加入以下试剂：
成分 用量 上述反应液 10μL M-MLV III逆转录酶(200U/μL) 1.0μL 5×M-MLV III Buffer 4.0μL DTT 1.0μL RNase抑制剂(40U/μL) 1.0μL 无核酸酶水 至20μL - 用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心后按下列程序进行反应（反应结束后立即置于冰上）：
温度 时间 25℃（可选） 10min 50℃ 30～60min 85℃ 5min 若逆转录引物用Random Primer时需要进行此步骤，其他引物可省略此步骤。
- 在上述反应管中加入以下试剂：
二、后续实验为qPCR
- 基因组DNA去除
- 在RNase-Free离心管中于冰上配制如下反应液：
成分 用量 RNA模板 50ng～1μg dsDNase 1.0μL 10×dsDNase Buffer 1.0μL 无核酸酶水 至10μL 推荐使用试剂盒提取的RNA作为模板。 - 用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心后42℃孵育2min，冰上迅速冷却。
- 在RNase-Free离心管中于冰上配制如下反应液：
- 逆转录反应
- 在上述反应管中加入以下试剂：
成分 用量 上述反应液 10μL M-MLV III逆转录酶(200U/μL) 1.0μL 5×M-MLV III Buffer 4.0μL Oligo dT Primer (50μM) 0.5μL Random Primer (50μM) 0.5μL DTT 1.0μL RNase抑制剂(40U/μL) 1.0μL 无核酸酶水 至20μL - 用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心后按下列程序进行反应（反应结束后立即置于冰上）：
温度 时间 50℃ 15min 85℃ 5min
- 在上述反应管中加入以下试剂：
常见问题：
- 逆转录后的cDNA产物进行qPCR检测，CT值偏高？
- 模板RNA提取失败或存在降解。建议在逆转录反应前一定要电泳验证RNA的完整性，提取RNA后尽快进行逆转录及qPCR操作；
- 基因表达量较低。可适当提高模板RNA用量；
- 逆转录体系、程序或加样等操作不当。建议按照说明书规范操作。
- 模板RNA提取失败或存在降解。建议在逆转录反应前一定要电泳验证RNA的完整性，提取RNA后尽快进行逆转录及qPCR操作；
- 反转录产物PCR扩增无条带？
- 模板RNA提取失败或存在降解。建议在逆转录反应前一定要对模板RNA进行电泳和OD值分析，RNA不要保存时间过长，尽快进行逆转录及PCR操作。
- 逆转录引物选择不当。含poly(A)的RNA逆转录引物使用oligo dT。
- 逆转录体系、程序及加样等操作不当，建议按照说明书规范操作。
- PCR模板cDNA浓度过高抑制PCR扩增，逆转录后以cDNA作为模板进行PCR扩增，建议将模板稀释5～10倍。
- 引物设计不合适。建议初次实验设计2-3对引物一起尝试。
- PCR程序不合适。建议尝试退火温度梯度或者Touchdown PCR程序。
- DNA聚合酶不合适或扩增效率低。建议多尝试几种DNA聚合酶。
- RNA模板具有复杂二级结构。建议增加RNA变性步骤。
- 模板RNA提取失败或存在降解。建议在逆转录反应前一定要对模板RNA进行电泳和OD值分析，RNA不要保存时间过长，尽快进行逆转录及PCR操作。
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