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高保真平末端pfu DNA聚合酶图片
产品货号:
RFT101
中文名称:
高保真平末端pfu DNA聚合酶
英文名称:
pfu DNA Polymerase
产品规格:
100U(40μl)|5×100U(5×40μl)
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本品是嗜热古细菌来源的DNA聚合酶,该酶除具有5’-3’DNA聚合酶活性外,还具有很强的3’-5’外切酶活性,增强了PCR扩增的保真度。与Taq酶相比,pfu聚合酶热稳定性更好,更能忍耐较高的变性温度。Pfu的保真性是Taq DNA聚合酶的10-15倍。延伸速度为0.5kb/分钟。PCR产物3’端不带碱基A,为平滑末端,要通过平滑末端克隆法进行克隆。适用于高保真的DNA片段的扩增、DNA片段的平滑化。

试剂盒组成:
pfu DNA Polymerase(2.5U/μl)-————————40μl
10×pfu PCR buffer(含Mg2+)—————————1ml

活性定义:1单位(U) pfu DNA Polymerase活力定义为在74℃、30分钟内,以活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸不溶物质所需的酶量。

贮存液:50 mM Tris-HCl (pH 8.0); 0.1 mM EDTA; 1 mM DTT; 50 mM KCl ; Stabilizers; 50% glycerol

使用方法:
1、按照下表在0.2ml PCR管中制备反应体系:
成分20μl反应体系50μl反应体系终浓度
Template0.04-0.2 μg0.1-0.5 μgas you wish
Primer 1(10μM)0.4μl1μl0.2μM
Primer 2(10μM)0.4μl1μl0.2μM
10×pfu PCR buffer(含Mg2+)2μl5μl
dNTP Mixture(10 mM)0.4μl1μl200μM each
pfu (2.5 U/μl)0.4μl1μl0.05U/μl
ddH2Oup to 20μlup to 50μl-

注1:如果需要改变Mg2+浓度,根据下表调节
PCR反应体系中Mg2+终浓度2 mM2.5 mM3 mM4 mM
20μl反应体系中25 mM MgSO4加入量0μl0.4μl0.8μl1.6μl
50μl反应体系中25 mM MgSO4加入量0μl1μl2μl4μl

注2:配制反应液时,请最后加入pfu,因为本酶有很强的3’-5’外切酶活性,有可能降解引物。
2、混匀后,离心快甩将反应液收集到管底。
3、PCR仪如果没有热盖加热的话,补加25μl矿物油。
4、PCR仪上执行以下程序:
步骤温度时间循环数
初始变性94℃3-5 min1
变性94℃30 sec25-40*
退火50-60℃*30 sec
延伸72℃0.5kb/min*
最后延伸72℃5 min1

注:PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异。在实际操作中需根据模板、目的片段的大小、碱基序列和引物的长短等具体情况,设定最佳的反应条件(温度、时间等)。

注意事项:
1、pfu 酶具有 3’-5’的外切酶活性,所以 pfu 酶扩增时延伸速度远比 Taq 酶低,应根据扩增产物的长度设置相应的延伸时间,一般情况下 pfu 酶的延伸速度为每分钟 0.5kb;同时 pfu 酶的 3’-5’的外切酶活性可能降解引物,所以应最后把pfu 酶到反应体系中,并立即进行 PCR 反应。
2、pfu 酶的热稳定性比 Taq 酶好,对于 GC 含量很高的模板,变性温度可以提高到98℃,对 pfu 酶的活性无影响。

储存条件:-20℃,有效期一年。
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