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本试剂盒适用于各种RNA制品的反转录反应以及随后的PCR扩增。它采用M-MLV进行反转录反应，能够获得较长的反转录产物。同时，在20μL反转录体系和50μL PCR反应体系中，还可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续的克隆实验。

本试剂盒中配制的酶均为进口的酶。RT酶采用进口的M-MLV，所以cDNA更长，基因的信息保留得更完整！反转录过程中特异的RNase抑制剂可有效降低由于外源RNase污染而导致实验失败的风险。本试剂盒使用方便、快捷，可广泛用于cDNA克隆及目的基因检测等分子生物学实验。

• 用于cDNA合成反应的相关试剂和耗材尽可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。
  
• 试剂盒的各组分应在-20℃保存，避免反复冻融，有效期12个月。
  
• RNA样品要避免反复多次冻融，应使RNA在冰浴中处于融化状态。

• 反转录反应
  
  • 在冰浴的无RNase的离心管中加入如下反应成分：
    

    成分		用量
    模板RNA	总RNA	1～5μg
    	mRNA	50～500ng
    反转录引物	Oligo(dT)16(10μM)	2μL
    	随机引物(10μM)	2μL
    	基因特异性引物	2pmol
    RNase-free ddH2O		14.5μL

    关于逆转录引物的选择：
    
    • 如果模板为真核生物来源，建议用Oligo(dT)₁₆，Oligo(dT)₁₆可以与真核生物mRNA的3' Poly(A)尾配对，可获得高产量的全长cDNA。
      
    • 模板为原核生物RNA的反转录请选用Random引物或者基因特异性引物。
      
    • 随机引物适用于mRNA、tRNA和rRNA等所有RNA的反转录反应，对物种没有限制，病毒、细菌、植物、动物等都可使用。
  • 70℃保温5min后迅速在冰上冷却2min，简短离心收集反应液后加入以下各组分：
    

    成分	用量
    5×M-MLV Buffer	4μL
    dNTPs(10mM)	1μL
    RNasin(40U/μL)	0.5μL
    M-MLV反转录酶(200U/μL)	1μL

  • 42℃温浴60min，如果是用Random引物，请先将离心管置25℃温浴10min，再42℃温浴60min。
    
  • 95℃加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或-20℃保存。
    
  • 用RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50μL，取2～5μL进行PCR反应。
• PCR反应
  
  • 按以下各组分配制50μL PCR反应体系
    

    成分	用量
    10×PCR Buffer	5μL
    dNTPs(10mM)	1μL
    上游引物(10μM)	1μL
    下游引物(10μM)	1μL
    上步RT反应产物	2μL
    Taq DNA聚合酶(5U/μL)	0.5μL
    ddH2O	至50μL

    
    
  • 混匀后短暂离心，PCR仪扩增，琼脂糖凝胶电泳观察结果。