产品货号:
MT3202
中文名称:
G5S Plus超高保真热启动DNA聚合酶
英文名称:
HotStart G5S Plus HiFi DNA Polymerase
产品规格:
100U|1000U
发货周期:
1~3天
产品价格:
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G5S Plus超高保真DNA聚合酶融合Q5和Q5U的性能于一身,使其成为一酶多用的全能选手。该酶来源于高保真DNA聚合酶,并加入了增强的延伸结构,使其具有超保真性能(与Q5同水平)、长片段扩增能力、高产量、dUTP渗入能力、扩增含有尿嘧啶模板的能力。使用该酶可轻松扩增8kb的基因组DNA、20kb的λDNA。该酶具有4kb/min以上的延伸速度。该酶具有5'-3'的聚合酶活性、强3'-5'的外切酶活性,产物为平末端。G5S Plus删除了尿嘧啶结合域,使其能够读取和扩增含有尿嘧啶的模板,该性能赋予其独特的“U”特征。
HotStart G5S Plus是G5S Plus超高保真DNA聚合酶的具有热启动功能的版本,由独特适配体封闭酶活性中心,在反应结束恢复室温后,适配体可逆的重新封闭聚合酶。其热启动功能确保,在25℃以下无活性(酶活泄漏<10%),高于50℃后迅速恢复100%活性。热启动功能便于室温建立反应体系、有效的降低低温下的非特异扩增、提高多重超保真扩增效果,使超保真扩增达到最佳。
- 超保真扩增:与Q5 DNA聚合酶同水平的保真性能,是载体构建、点突变、NGS模板扩增、基因合成的最佳用酶。
- 识别dUTP底物:能够读取和扩增含有尿嘧啶的模板,具有“U”特征。
- 防污染扩增:在PCR扩增中可以使用dUTP完全替代dTTP,建立防污染高保真扩增。
- 快速扩增:具有4kb/min的扩增能力。
- 长片段扩增:质粒、λDNA等简单模板>20kb,复杂基因组模板>8kb。
一个活力单位即在72℃条件下,30分钟内催化10nmol dNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量。
组分 | 100U | 1000U |
HotStart G5S Plus Polymerase(2U/μL) | 50μL | 500μL |
5×G5S Buffer 1 | 1.25mL | 15mL |
5×G5S Buffer 2 | 1.25mL | 1.25mL |
保存:-20℃,有效期2年。
10mM Tris-HCl(pH7.6),100mM NaCl,0.05% Tween20,1mM DTT,0.5mM EDTA,50%甘油。
- G5S Buffer 1用于4kb以下的片段扩增,及多重扩增,Buffer 1总能获得更特异的单一条带;
- G5S Buffer 2是高产PCR和复杂模版扩增的专用Buffer,用于4kb以上片段扩增,在扩增良好的引物条件下,Buffer 2总能获得更高的产量。
- 引物、模板、酶浓度使用参考表
在1×反应
体系下引物浓度
(nM)酶浓度
(mU/μL)模板浓度
(ng/μL)<4kb 200 20 基因组(0.01~1)
简单模板(0.01~0.1)>4kb 100 20~40 基因组(0.05~4)
简单模板(0.01~0.1) - 在进行防污染扩增时,dNTP中的dTTP可用dUTP来代替,dUTP占比75~100%。该酶可以用dUTP完全取代dTTP,扩增效率有所下降,但通常不影响下游应用(建议扩增片段<1kb)。在防污染扩增时,通常需要搭配热敏UDG酶来实现污染物的去除,热敏UDG的使用浓度通常为(0.01~0.05U/μL)。
- 扩增片段GC含量>65%时,推荐添加5×PCR增强剂至1×浓度,来提升高GC含量的扩增性能。
- 1×G5S Buffer 1和2,含有1.5mM Mg2+,必要情况下可调整用量。
- 按下表配制PCR反应液
成分 用量 终浓度 5×G5S Buffer 4μL 1× HotStart G5S Plus(2U/μL) 0.2μL 20mU/μL dNTP Mixture (10mM each) 0.4μL 200μM 上游引物(10μM) 0.4μL 200nM 下游引物(10μM) 0.4μL 200nM 模板DNA X μL ddH2O 至20μL - 推荐的PCR扩增程序
过程 温度 不同长度的模板DNA片段的时间参数 <0.5kb <1kb 1~2kb 2~3kb >3kb 预变性 95℃ 1min 1min 1min 1min 1min 循环1
(5个循环)95℃ 10s 10s 10s 10s 10s 65℃ 15s 30s 45s 90s 2kb/min 循环2
(23个循环)95℃ 10s 10s 10s 10s 10s 55℃ 10s 10s 10s 10s 10s 72℃ 15s 30s 45s 90s 2kb/min 终延伸 72℃ 1min 1min 1min 1min 1min - 在实际应用中,引物TM值(50~70℃)范围内均获得良好的扩增。该程序扩增总循环数为28(5+23),如产物扩增亮度不足,则增加循环2的次数到25~28个,通常不宜超过28。
- 如果仍然不能获得良好的扩增结果,则可以改变,循环2中的退火温度为50~65℃(上表中为55℃)。
- 在实际应用中,引物TM值(50~70℃)范围内均获得良好的扩增。该程序扩增总循环数为28(5+23),如产物扩增亮度不足,则增加循环2的次数到25~28个,通常不宜超过28。
- 不同长度片段的扩增图(最高到20kb)
G5S Plus扩增性能展示:500bp~8kb是以gDNA为模板进行扩增,15~20kb是以λDNA为模板进行扩增。酶的使用浓度为:0.02~0.04U/μL。 - 不同酶用量的扩增性能
以λDNA为模板(40pg/μL)扩增1kb的片段,在0.01U/μL的酶浓度下即可有效扩增。
以gDNA为模板(2ng/μL)扩增5kb的片段,在0.02U/μL的酶浓度下即可有效扩增。 - 模板扩增灵敏度展示
A.以gDNA为模板扩增500bp的产物,该酶可扩增低至10pg的gDNA(约3~5个细胞)
B.以gDNA为模板扩增2kb的产物,该酶可扩增低至100pg的gDNA(约30~40个细胞)。
酶的工作浓度为0.04U/μL。 - GC-rich模板的扩增
以人基因组DNA为模板扩增1250bp的高GC(67%)片段,在1×PCR增强剂的条件下,可扩增低至2ng的模板,酶的工作浓度为0.02U/μL。 - dUTP模板扩增性能
重硫酸盐处理DNA后,未发生甲基化的C碱基转化为U碱基,G5S Plus可用于高保真扩增DNA甲基化实验,扩增产物为500bp,酶的工作浓度为0.04U/μL。 - 高保真度扩增性能
使用DNA聚合酶对模板DNA进行35个循环的PCR扩增后,对PCR进行NGS测序,结果表明G5S Plus与Q5 DNA聚合酶保真度相当。 - HotStart G5S Plus热启动性能展示
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