产品目录

G5S Plus超高保真DNA聚合酶来源于高保真DNA聚合酶，并加入了增强的延伸结构，使其具有超保真性能、长片段扩增能力、高产量、dUTP渗入能力、扩增含有尿嘧啶模板的能力。使用该酶可轻松扩增8kb的基因组DNA、20kb的λDNA。该酶具有4kb/min的延伸速度。该酶具有5'-3'的聚合酶活性、强3'-5'的外切酶活性，产物为平末端。

• 用于超保真扩增重亚硫酸氢盐转化、脱氨基、或受损DNA；
  
• 在超保真扩增中搭配dUTP和热敏UDG，用于防止PCR体系中携带污染。除此外，也多用于USER克隆。

• 超保真扩增：与Q5 DNA聚合酶同水平的保真性能，是载体构建、点突变、NGS模板扩增、基因合成的最佳用酶。
  
• 识别dUTP底物：能够读取和扩增含有尿嘧啶的模板，具有“U”特征。
  
• 防污染扩增：在PCR扩增中可以使用dUTP完全替代dTTP，建立防污染高保真扩增。
  
• 快速扩增：具有4kb/min的扩增能力。
  
• 长片段扩增：质粒、λDNA等简单模板>20kb，复杂基因组模板>8kb。

• G5S Buffer 1用于4kb以下的片段扩增，及多重扩增，Buffer 1总能获得更特异的单一条带。
  
• G5S Buffer 2是高产PCR和复杂模版扩增的专用Buffer，用于4kb以上片段扩增，在扩增良好的引物条件下，Buffer 2总能获得更高的产量。

• 引物、模板、酶浓度使用参考表
  

  在1×反应 体系下	引物浓度 (nM)	酶浓度 (mU/μL)	模板浓度 (ng/μL)
  <4kb	200	20	基因组（0.01～1） 简单模板（0.01～0.1）
  >4kb	100	20～40	基因组（0.05～4） 简单模板（0.01～0.1）

• 在进行防污染扩增时，dNTP中的dTTP可用dUTP来代替，dUTP占比75～100%。该酶可以用dUTP完全取代dTTP，扩增效率有所下降，但通常不影响下游应用(建议扩增片段<1kb)。在防污染扩增时，通常需要搭配热敏UDG酶来实现污染物的去除，热敏UDG的使用浓度通常为（0.01～0.05U/μL）。
  
• 扩增片段GC含量>65%时，推荐添加5×PCR增强剂至1×浓度，来提升高GC含量的扩增性能。
  
• 1×G5S Buffer 1和2，含有1.5mM Mg²⁺，必要情况下可调整用量。

• 按下表配制PCR反应液
  

  成分	用量	终浓度
  5×G5S Buffer	4μL	1×
  G5S Plus DNA Polymerase(2U/μL)	0.2μL	20mU/μL
  dNTP Mixture (10mM each)	0.4μL	200μM
  上游引物（10μM）	0.4μL	200 nM
  下游引物（10μM）	0.4μL	200 nM
  模板DNA	X μL
  ddH2O	至20μL

  
  
• 推荐的PCR扩增程序
  

  过程	温度	不同长度的模板DNA片段的时间参数
  		<0.5kb	<1kb	1～2kb	2～3kb	>3kb
  预变性	95℃	1min	1min	1min	1min	1min
  循环1 (5个循环)	95℃	10s	10s	10s	10s	10s
  	65℃	15s	30s	45s	90s	2kb/min
  循环2 (23个循环)	95℃	10s	10s	10s	10s	10s
  	55℃	10s	10s	10s	10s	10s
  	72℃	15s	30s	45s	90s	2kb/min
  终延伸	72℃	1min	1min	1min	1min	1min

  
  
  • 在实际应用中，引物TM值（50～70℃）范围内均获得良好的扩增。该程序扩增总循环数为28（5+23），如产物扩增亮度不足，则增加循环2的次数到25～28个，通常不宜超过28。
    
  • 如果仍然不能获得良好的扩增结果，则可以改变，循环2中的退火温度为50～65℃（上表中为55℃）。

• 不同长度片段的扩增图（最高到20kb）
  
  G5S Plus扩增性能展示：500bp～8kb是以gDNA为模板进行扩增，15～20kb是以λDNA为模板进行扩增。酶的使用浓度为：0.02～0.04U/μL。
  
• 不同酶用量的扩增性能
  
  以λDNA为模板(40pg/μL)扩增1kb的片段，在0.01U/μL的酶浓度下即可有效扩增。
  以gDNA为模板(2ng/μL)扩增5kb的片段，在0.02U/μL的酶浓度下即可有效扩增。
  
• 模板扩增灵敏度展示
  
  A.以gDNA为模板扩增500bp的产物，该酶可扩增低至10pg的gDNA(约3～5个细胞)
  B.以gDNA为模板扩增2kb的产物，该酶可扩增低至100pg的gDNA(约30～40个细胞)。
  酶的工作浓度为0.04U/μL。
  
• GC-rich模板的扩增
  
  以人基因组DNA为模板扩增1250bp的高GC(67%)片段，在1×PCR增强剂的条件下，可扩增低至2ng的模板，酶的工作浓度为0.02U/μL。
  
• dUTP模板扩增性能
  
  重硫酸盐处理DNA后，未发生甲基化的C碱基转化为U碱基，G5S Plus可用于高保真扩增DNA甲基化实验，扩增产物为500bp，酶的工作浓度为0.04U/μL。
  
• 高保真度扩增性能
  
  使用DNA聚合酶对模板DNA进行35个循环的PCR扩增后，对PCR进行NGS测序，结果表明G5S Plus与Q5 DNA聚合酶保真度相当。