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本试剂盒基于耐热的Bst7.0 DNA聚合酶，用于DNA模板的LAMP高效扩增反应，扩增完毕后可用浊度分析、浊度仪或搭配OTG橙绿变色反应管观察结果。

Bst 7.0 DNA聚合酶为经重构架设计保留了Bst DNA聚合酶的链置换活性，并提高了其温度耐受性，该酶可以耐受85℃加热。这种短暂的高温耐热性能，具有以下几个优点。

• 在高温85℃加热2min后，可以将双链DNA进行变性，提高了引物的结合能力，从而提高LAMP检测的灵敏度。
  
• 在未经处理的检测样本中，可实现扩增反应同时裂解样本（从组织中释放DNA），从而实现核酸免提取的LAMP扩增。
  
• 在高温条件下打开引物的非特异性结构，明显降低LAMP反应的非特异性扩增。
  
• 短暂的高温可瞬时灭活病毒，降低检测样品的生物安全性。除此外，Bst7.0 DNA聚合酶中不含有甘油成分，因此可用于建立LAMP引物mix与酶制品的冻干品，以提高LAMP检测制品的稳定性和易用性。除此外，该制品还可以用于其它恒温扩增实验，包括CPA、SMAP等。

• Bst7.0 DNA聚合酶中含22%海藻糖，不含甘油，可用于冻干。
  
• 关于矿物油的使用，在配制完LAMP反应体系后，可加入一滴矿物油覆盖于反应液上部，以减少气溶胶的污染。
  
• 在用于其它恒温扩增反应时（如CPA、SMAP等），可参考如下策略进行使用，反应时间可能会需要调整。

• 配制LAMP反应体系：
  
  • 向0.2mL EP反应管中加入各成分：
    

    成分	用量
    2×Hot IsoAmp Buffer	10μL
    Bst7.0 DNA聚合酶(3.2U/μL)	2.5μL
    10×LAMP Primer Mix	2μL
    模板DNA(或粗样本)	X μL
    ddH2O	至20μL

    • 10×LAMP Primer Mix浓度：FIP/BIP 16μM each、LoopF/B 4μM each、F3/B3 2μM each。
    • 首次实验时LAMP Primer Mix分别采用1、1.5、2μL，以阴性不变色，阳性样品正常变色为准，作为后续测试用量。
  • 全部试剂加入完毕后，轻弹EP管底部后，再盖上OTG橙绿变色管。
    
    • 盖上管盖后务必不能再剧烈混合与倒置，以防止将管盖上的OTG染料溶解，OTG染料一旦混入反应液中将会终止LAMP反应。
• LAMP扩增程序：反应体系配好后，置于60～72℃（首次实验采用65℃）进行反应20～45min。
  
  • 采用标准PCR仪作为反应设备时，还能采用灵敏度更高的加热方法进行LAMP反应。
    

    温度	时间
    85℃	2min
    60～72℃（首次实验采用65℃）	20～45min

• 结果判定：观察结果时，尽可能不要与配制反应空间共用，以防止污染操作台。将反应EP管倒置，并手腕轻甩，反应液浸泡EP管盖上的OTG染料，静置30s。再将EP反应管正置，并轻甩反应液到EP管底部，此时扩增样品将变为鲜艳肉眼可见绿色，而阴性未发生扩增的管将为深橙色。

• 在0.2mL EP反应管中加入下述试剂配制LAMP反应体系
  

  成分	用量
  2×Hot IsoAmp Buffer	10μL
  Bst7.0 DNA Polymerase	2.5μL
  10×LAMP Primer Mix	2μL
  模板DNA(或粗样本)	X μL
  ddH2O	至20μL

  • 10×LAMP Primer Mix浓度：FIP/BIP分别为16μM、LoopF/B分别为4μM、F3/B3分别为2μM。
  
  
• 反应体系配好后，置于60～72℃（首次实验采用65℃）进行反应20～45min，连接LAMP实时浊度仪，对浊度变化进行实时检测。也可肉眼分别于30min、45min、60min观察浊度变化。
  
  • 采用标准PCR仪作为反应设备时，还能采用灵敏度更高的加热方法进行LAMP反应。
    

    温度	时间
    85℃	2min
    60～72℃（首次实验采用65℃）	20～45min

• 引物及酶制品的冻干（可参考）
  

  成分	用量
  Bst7.0 DNA聚合酶	2.5μL
  10×LAMP Primer Mix	2μL
  45%海藻糖	0.5μL
  总体积	5μL

  将该制品进行冻干处理，获得冻干品。
  
• 冻干制品的LAMP扩增
  向一份冻干品中加入10μL的2×Hot IsoAmp Buffer溶解冻干制品，并加入最多10μL的检测DNA模板，总体积为20μL。进行LAMP扩增。