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推荐升级替代产品：探针法qPCR预混液(含UDG)(货号：MT2005)

本制品将化学修饰的热启动Taq DNA聚合酶、UNG酶、反应Buffer、dUTP/NTP Mixture等试剂预混在一起，是一种5×浓度的单组分预混试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单，只需加入引物、探针、模板、水即可。

本制品中的DNA聚合酶为化学法修饰的Hot Start Taq DNA聚合酶，该酶在50℃以下100%无活性，只有95℃条件下加热15min后才能完全恢复酶的活力。因此该系统可以有效抑制非特异性PCR扩增，极大的提高了PCR扩增特异性。该试剂盒独特的反应缓冲液，可在宽范围中得到良好的扩增结果、检测灵敏度更高、信号更强。该制品配有单独的ROX内参染料，使得该试剂可应用于所有RealTime PCR机型。

由于PCR对核酸的扩增效率极高，在诊断PCR实验中，非常容易造成移液器、台面、PCR仪、空气等气溶胶污染。当实验环境被污染后，会导致阴性样本的假阳性结果。本TaqMan探针法定量试剂中，将dNTP中的dTTP全部更换为dUTP，从而使得扩增后的PCR产物中包含dU碱基。在随后的实验中，含有气溶胶污染的dU PCR产物，将被本试剂中的UNG糖基化酶降解，从而去除了气溶胶的污染效应，本试剂中的UNG酶在37度孵育2分钟，即可消除高达10万个Copy的核酸污染物。因此，本制品是诊断定量PCR检测的最佳试剂。

产品组成：

名称	100T×20μL	500T×20μL
5×Probe qPCR MasterMix (UDG)	0.4mL	0.4mL×5
50×ROX Reference Dye	200μL	200μL

保存条件：-20℃，有效期2年。长期-20℃保存可能会出现沉淀，室温融化后混合均匀，不影响试剂性能。经常使用，融化后可置于4℃，可保存1年

产品特点：

• 热启动酶采用化学修饰，100%热启动
• 引入UNG，可高效消除气溶胶污染
• 单组份预混液，使用方便快捷
• 高特异性，有效抑制非特异性扩增
• 高灵敏度，可检测低丰度基因
• 适用于所有实时定量PCR仪器

反应实例：

以pUC57质粒为模板，将该模板进行8个4倍稀释，第8个稀释梯度中模板拷贝数为10copy/μl，用5XHi TaqMan qPCR Mix(UNG)进行扩增检测，每个反应体系加模板2μL，如图所示，

• 本制品在宽广的模板量区间内具有卓越的线性关系：扩增效率97.5%，R2 =0.9995。
• 测试UNG去除DNA污染的能力，向反应体系中加入10⁵copy的含dUTP的PCR产物，分别用以下产品做定量PCR。
  B1：5×Probe qPCR MasterMix，货号是MT0018
  B2：5×Probe qPCR MasterMix (UNG)，货号是MT0191
  从图中可以看出：UNG可很好的去除10⁵copy的气溶胶污染。
• 图A扩增的标准曲线。

使用方法：

• 根据机型选择步骤A或B
  A．需要添加ROX染料进行反应孔间信号矫正的Real-TimePCR仪，包括：ABI PRISM7000/7700/7900HT,7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems)；Mx3000P (Stratagene)等。按照如下组分配制20μL PCR反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  5×Probe qPCR MasterMix	4μL	1×
  50×ROX Reference Dye	0.4μL	1×
  PCR Forward Primer(10μM)	0.8μL	0.4μM
  PCR Reverse Primer(10μM)	0.8μL	0.4μM
  TaqMan Probe (10μM)	0.4μL	0.2μM
  DNA模板	0.5～2μL	-
  ddH2O	Up to 20μL	-

  
  
  B．无需添加ROX染料进行反应孔间信号矫正的Real-TimePCR仪，包括：LightCycler (Roche Diagnostics)；MiniOpticon、Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-TimePCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)等。按照如下组分配制20μL PCR反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  5×Probe qPCR MasterMix	4μL	1×
  PCR Forward Primer(10μM)	0.8μL	0.4μM
  PCR Reverse Primer(10μM)	0.8μL	0.4μM
  TaqMan Probe (10μM)	0.4μL	0.2μM
  DNA模板	0.5～2μL	-
  ddH2O	Up to 20μL	-

  
   
• 进行Real-Time PCR反应，通常采用两步法，程序如下：
  

  阶段	温度	时间	循环数
  Stage 1:	37℃	2min(消化污染物)	1
  Stage 2:	95℃	15min(热启动)	1
  Stage 3:	95℃	10s	40~45
  	60℃	30s

  
  注意：由于该酶为化学修饰的热启动Taq DNA聚合酶，必须于95℃加热15min才能恢复酶的活性，该热启动步骤不能缩短或延长。
   
• 反应结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线和标准曲线。

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