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本产品是用于快速PCR的高保真DNA聚合酶，是Pfu DNA聚合酶(货号：LA11072)的升级版本，与上一代产品相比，本产品中添加了独特的延伸因子及特异性促进因子，使其扩增能力强、扩增速度快(2～4kb/min，是普通Pfu酶的4～8倍)，克服了普通Pfu酶扩增能力差、产量低和扩增速度慢(0.5kb/min)的缺陷，极大地缩短了反应时间。以人基因组为模板，本产品可以很好地扩增DNA片段(≤21kb)。本产品的PCR产物为平末端，可加A处理再与T-载体连接或使用平末端克隆载体。本产品PCR反应体系优先在冰上配制，但在室温放置1h对结果无明显影响。

• 操作注意事项
  本品PCR反应体系优先在冰上进行配制，之后再置于PCR仪上进行反应。这样可以减少在反应准备阶段发生的非特异扩增，有助于得到高特异性的扩增结果。
  
• 引物设计要点
  
  • 引物3’端最后一个碱基最好为G或者C；
    
  • 引物3’端最后8个碱基应避免出现连续错配；
    
  • 引物3’端应避免出现发夹结构；
    
  • 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过1℃为佳，Tm值调整至55～65℃为佳(引物Tm值推荐使用Primer Premier 5进行计算)；
    
  • 引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算；
    
  • 引物的GC含量控制在40～60%之间；
    
  • 引物A、G、C、T整体分布要尽量均匀，避免使用GC或者AT含量高的区域；
    
  • 避开引物内部或者两条引物之间有5个碱基以上的互补序列，两条引物的3’端避免3个碱基以上的互补序列；
    
  • 引物设计完毕请使用NCBI BLAST功能检索引物特异性，以避免非特异性扩增产生。

• PCR反应体系
  

  成分	用量
  ddH2O	至50μL
  2×QE Hi-Fi Buffer (with Mg2+)	25μL
  dNTP Mix (10mM each)	1μL
  模板DNA	optional
  引物1(10μM)	2μL
  引物2(10μM)	2μL
  QuickExtend Hi-Fi DNA Polymerase(2.5U/μL)	1μL

  
  注：
  
  • Mg²⁺终浓度：本品已含有2mM Mg²⁺，如有需要，可适当调整Mg²⁺浓度至2～4mM。
    
  • 聚合酶添加：室温下聚合酶有一定程度的5’-3’聚合酶活性，为了防止非特异性扩增，建议将聚合酶在最后一步加到反应体系中。
    
  • 聚合酶量：推荐使用1μL。可以在0.5～1μL之间进行优化。
    
  • 不同模板的推荐使用量(50μL反应体系)：
    

    模板种类	扩增片段
    基因组DNA	100ng～1μg
    质粒DNA	10pg～20ng
    cDNA	1～5μL(不超过反应体系的1/10)

  
  
• PCR扩增程序
  
  • 目的片段＜5kb
    

    循环步骤	温度	时间	循环数
    预变性	95℃	30sec～3min	1
    变性	95℃	20～30sec	30-35
    退火	50～60℃	30sec
    延伸	72℃	2～4kb/min
    终延伸	72℃	5～10min	1

    
    
  • 目的片段＞5kb
    

    循环步骤	温度	时间	循环数
    预变性	95℃	30sec～3min	1
    变性	95℃	20～30sec	30-35
    退火/延伸	68℃	1～2kb/min
    终延伸	72℃	5～10min	1

  
  注：
  
  • 预变性温度和时间：推荐使用95℃。预变性推荐时间：质粒DNA等简单模板为30sec；cDNA、基因组DNA等复杂模板为3min。
    
  • 退火温度和时间：推荐使用50～60℃，也可根据需要，设立温度梯度去摸索引物退火的最适温度。推荐退火时间设置为20sec，可以在10～30sec内调节。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈弥散状。
    
  • 对于>5kb的片段，推荐使用长引物，设计引物Tm值在68～70℃，把退火/延伸温度合并为68℃。这样可以显著提高扩增特异性。
    
  • 扩增产物：请将PCR扩增产物放置于-20℃保存，防止DNA发生降解。