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本产品是实时荧光定量PCR的预混合溶液，采用SYBR Green I染料法，仅需要加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，减少操作步骤，降低污染几率。产品中包含热启动Taq DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTP、Mg²⁺。本产品中的热启动Taq酶是采用抗体封闭法，经qPCR反应程序中的预变性阶段后即可释放Taq DNA Polymerase酶活，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增，同时配以针对染料法qPCR优化的Buffer，使实时荧光定量PCR具有更高的特异性和灵敏度。本产品针对不同型号的实时荧光定量PCR仪，分别提供不同浓度的Rox参比液(High Rox/Low Rox)，用于校正孔与孔之间的荧光信号误差。

• High Rox适用机型：
  ABI 5700,7000,7300,7700,7900HT Fast,StepOne,StepOne Plus;
  
• Low Rox适用机型：
  ABI 7500,7500 Fast,ViiA7,QuantStudio 3 and 5,QuantStudio6,7,12k Flex;
  StratageneMX3000P,MX3005P,MX4000P;
  
• 不需要Rox校正的仪器型号：
  Bio-Rad CFX96,CFX384,iCycler iQ,iQ5,MyiQ,MiniOpticon,Opticon,Opticon 2,Chromo4;
  Eppendorf Mastercycler ep realplex,realplex 2 s;
  Qiagen Corbett Rotor-Gene Q,RotorGene 3000,Rotor-Gene 6000;
  Roche Applied Science LightCycler 480,LightCycler 2.0;Lightcycler 96;
  Thermo Scientific PikoReal Cycler;
  Cepheid SmartCycler;Illumina Eco qPCR.

• PCR反应体系
  

  成分	用量
  2×qPCR SYBR Green Master Mix	10μL
  模板DNA	optional
  引物1(10μM)	0.4μL
  引物2(10μM)	0.4μL
  50×High/Low Rox	0.4μL
  Nuclease-free water	至20μL

  
  注：
  
  • 引物浓度：一般来说引物终浓度为0.2μM，也可以根据反应情况在0.1～1.0μM范围内进行调整。
    
  • 模板用量：qPCR灵敏度极高，反应体系中模板用量对最终检测结果会有很大影响。建议将模板稀释后再加入反应体系中，如有必要可进行梯度稀释，确定最适的模板浓度，最佳模板用量以扩增得到的CT值在20～30个循环为好。如模板为cDNA原液，使用体积不应超过qPCR总体积的1/10。
    
  • 由于本品检测灵敏度极高，为避免交叉污染和气溶胶污染，请于超净工作台内配制，并使用带滤芯的无核酸酶的枪头以及反应管。
    
  • 本品中含有荧光染料SYBR Green I，因此需避光保存，配制反应体系时应尽量避免强光照射。
    
  • 使用前解冻Master Mix并轻轻上下颠倒混匀，混匀后经短暂离心即可使用。如每次使用量小，可进行分装，避免反复冻融和剧烈涡旋，以免造成酶活下降。
• 按下列条件进行qPCR反应
  

  循环步骤	温度	时间	循环数
  预变性	95℃	1min	1
  变性	95℃	10sec	40-45
  退火/延伸	60℃	30sec
  熔解曲线	仪器默认设置		1

  
  注：
  
  • 该预变性条件适用于大多数扩增反应，可根据模板和引物的具体情况适当延长预变性时间。
    
  • 退火/延伸的温度及时间可根据引物和目的基因的长度进行调整。
    
  • 熔解曲线：通常情况下使用仪器默认熔解曲线程序即可。

• 无扩增曲线出现
  
  • 确认反应程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增效率程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序中将信号采集设置在延伸阶段。
    
  • 模板降解，重新制备模板，重复实验。
    
  • 体系中存在PCR抑制剂，一般为模板带入，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
• 熔解曲线出现多峰
  
  • 可通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。
    
  • 若为引物二聚体，可适当降低引物浓度，或重新设计扩增效率高的引物。
    
  • 如模板为cDNA，出现熔解曲线多峰，说明模板中带有基因组污染，需重新制备cDNA模板。
• 阴性对照出现明显扩增
  
  • 反应体系污染：更换新的Master Mix、水、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制，并使用带滤芯的枪头，减少气溶胶污染。
    
  • 配合熔解曲线分析，出现的扩增曲线是否为引物二聚体。
• 扩增曲线性状异常
  
  • 个别扩增曲线出现突然骤降：反应管内有气泡残留，处理样本时要注意离心，避免反应管内有气泡残留。
    
  • 扩增曲线不光滑：模板浓度低，信号弱。提高模板浓度重复实验。