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本制品是LAMP MasterMix和免提取样本DNA释放剂的组合。前者含有荧光染料法LAMP扩增所需的所有成分，可以用于荧光染料法LAMP等温扩增。免提取样本DNA释放剂可用于处理各种样品，直接不经过提取直接用于PCR或LAMP扩增。

• 即开即用，用户不需要单独准备每个成分。
  
• 不需要单独进行核酸纯化。
  
• 含有荧光染料，如果使用荧光扩增仪（如荧光PCR仪），则可以进行实时荧光LAMP定性检测。不建议用于实时荧光LAMP定量检测，因为LAMP技术本身并不适合用于定量检测。
  
• 灵敏度比常规的电泳法LAMP检测一般高10倍，比常规PC高100倍。
  
• 闭管操作，不需要再打开反应管，避免了常规LAMP电泳取样时引起的扩增产物污染。
  
• 高特异性，本公司精心优化的MasterMix配方，假阳性率一般比自配的LAMP试剂更低。
  
• 本试剂盒足够50次免提取样本处理和50次20μL体系的LAMP扩增。
  
• 提供扩增对照，便于在遇到困难时分析原因。
  
• 本制品只能用于科研，不能用于临床。

• 打开金属浴或PCR仪，把温度调到95℃。
  
• 配制1mL工作液（足够10个样品，如果样品不止10个，需要按比例增加）：在一干净的1.5mL自备塑料离心管中加入10μL免提取模板制备溶液A成分1，20μL免提取模板制备溶液A成分2和970μL超纯水，充分混合均匀待用。溶液A工作液可室温放置，但最好在一周内用完。
  
• 标记10个PCR管（方便后续用PCR仪加热保温），分别加入100μL上步所配制的溶液A工作液。
  
• 参考下表在管中加入待处理样品。如果是固体样品，需要确保固体样品被溶液A工作液淹埋，如果是液体样品则震荡混匀即可。动物组织1～5mg、鼠尾2mm、血液样品不超过20μL、植物叶片1～5mg、植物种子1～5mg、0.2～0.5mL微生物培养物离心所得的沉淀、血清血浆等蛋白浓度高的液体样品10～30μL、其他液体样品（如保存液中的病毒样品）50～100μL。对上表未列出的样品，用户需要自己摸索最佳用量。对富含多醌多酚的植物材料（如棉花），使用量最好不要超过0.5mg。
  
• 在金属浴或PCR仪上95℃保温10分钟。
  
• 待冷却到常温。
  
• 每个管中加入10μL溶液B并轻柔吹打混匀得DNA释放液。这些DNA释放液足够进行50-100次PCR或LAMP扩增。
  
• 配制5×LAMP引物混合液。
  先加超纯水将合成的HPLC级别的下列引物干粉稀释到标准所标注的母液浓度，然后在一新的离心管中按表中所列体积加入各种引物母液和超纯水，最后得到1mL的5×LAMP引物混合液，此混合液足够250次20μL体系的LAMP扩增。如果需要配制的5×LAMP引物混合液体积异于1mL，则各成分的用量请按比例调整。引物混合液可以在-20℃放置2年。
  

  引物名称	母液浓度	加母液量	在5×LAMP引物混合液中的浓度
  FIP引物	100μM	80μL	8μM
  BIP引物	100μM	80μL	8μM
  F3引物	100μM	10μL	1μM
  B3引物	100μM	10μL	1μM
  Loop F	100μM	20μL	2μM
  Loop B	100μM	20μL	2μM
  超纯水		780μL
  终体积		1mL

  如果没有Loop引物，则用水替代。
  
  
• 在冰上融化4×LAMP MasterMix（荧光染料法），混匀，稍离心。第一次使用时，请将50μL Bst DNA聚合酶2.0全部加入到4×SYBR LAMP MasterMix中轻柔混匀，然后再使用。如果有N个样品，则在N+2个反应管中加入以下组份，多出的一管是LAMP扩增阳性对照（PC），一管是LAMP扩增阴性对照（NC）：
  

  成分	N+2个样品管	LAMP扩增PC	LAMP扩增NC
  4×SYBR LAMP MasterMix(已加酶)	5μL	5μL	5μL
  自备5×LAMP引物混合液	4μL	不加	4μL
  阳性对照模板-引物混合物	不加	4μL	不加
  自备模板DNA	1～2μL	不加	不加
  补自备超纯水到	20μL	20μL	20μL

• 混匀，置于65℃保温60分钟。如果是在PCR仪中保温，必须加热盖。如果用金属浴或水浴保温，没有热盖，必须覆盖50μL的石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，严重影响反应效率。
  
• 电泳分析：由于取样时非常容易产生气溶胶污染，污染实验环境并且非常难清除污染，所以强烈建议不要采取此方法分析实验结果。即使使用，也要在不同的房间，使用不同的移液枪操作。具体做法是取10μL LAMP扩增产物跟自备上样液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳。LAMP阳性对照必须有正常LAMP条带（200bp左右的梯形扩增产物），LAMP阴性结果必须无条带，否则实验结果无效。如果LAMP阳性对照和阴性对照结果正常，再分析待测样品。奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果。
  
• 荧光分析（仅限于用qPCR仪进行反应的场景）：样品制备阳性对照和LAMP阳性对照的反应液将有标准的S扩增曲线，样品制备阴性对照和LAMP阴性对照的反应液将没呈平线，没有S曲线，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的荧光曲线为S型，则说明样品为阳性，如果为平线则说明待测样品为阴性。