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本制品是专门用于检测大肠杆菌基因的探针法qPCR Master Mix。目前大多数Taq DNA聚合酶都是从大肠杆菌中表达并提取，因此不可避免地污染有痕量的大肠杆菌基因组DNA。当含有这些Taq DNA聚合酶的PCR MasterMix用于扩增大肠杆菌基因组DNA时，在空白样本或模板浓度很低的样本中，大肠杆菌专一的引物和探针将识别Taq DNA聚合酶带来的痕量的大肠杆菌基因组DNA，产生假阳性。为了克服此棘手问题，本公司开发了本制品。

• 用特殊工艺除去了Taq DNA聚合酶中痕量大肠杆菌DNA污染，在扩增大肠杆菌样本时不会出现假阳性。
  
• 以2×Mix提供，用户只需准备模板、引物、探针和ROX染料（取决于qPCR仪器）即可以进行探针法实时定量PCR实验，非常方便快捷，降低了操作误差。
  
• 各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。灵敏度最高时可以达到50拷贝/反应（跟模板质量，引物设计等相关）。
  
• 既可用于TaqMan探针qPCR，也可以是分子信标探针qPCR。
  
• 灵敏度和专一性比染料法荧光定量PCR更高。
  
• 可用于大肠杆菌基因组DNA定性实验，也可以用于定量检测。用于定量时线性范围至少为5个数量级。
  
• 本制品反复冻融20次对扩增效果没有任何影响。

• 如果有N个样品并且做定量分析，最好设置N+7个反应，多出的7个中，6个是做标准曲线的阳性对照，一个是阴性对照（NC）。在N+7个PCR管中，加入下列成分。如果是做定性分析，则6个做标准曲线的样品缩减成一个阳性对照（PC），用户自己需要根据下表进行适当修改（把6个标曲反应改成1个阳性对照反应）。
  

  成分	N个样品管	6个标准曲线管	NC管
  2×探针法qPCR MasterMix(大肠杆菌专用)	各10μL	各10μL	10μL
  自备引物1（10μM）	各1μL	各1μL	1μL
  自备引物2（10μM）	各1μL	各1μL	1μL
  基因组DNA模板	10～100ng	不加	不加
  或cDNA模板	1～10ng	不加	不加
  自备阳性对照模板（6个梯度）	不加	各1μL（各加1个梯度）	不加
  阴性对照模板（一般用水）	不加	不加	1μL
  自备探针（5μM）	各1μL	各1μL	1μL
  自备50×ROX I或ROX II染料（见注）	各0.4μL	各0.4μL	0.4μL
  补超纯水到	20μL	20μL	20μL

  
  
• 放入荧光PCR仪中进行扩增，下表的扩增参数仅供参考，一定需要根据靶分子长度，引物和探针的Tm值、标记染料的种类等进行调节。一般选择三步法PCR：
  

  步骤	反应参数	备注
  预变性	94℃ 2分钟
  PCR反应 （35～45次循环）	94℃ 15秒	靶分子长度最好在80～200bp
  	55～65℃ 15～30秒
  	72℃ 30秒	在此步采集荧光信号，通道根据标记染料决定

  
  如果引物Tm值接近60℃，也可以选择两步法PCR：
  

  步骤	反应参数	备注
  预变性	94℃ 2分钟
  PCR反应 （35～45次循环）	94℃ 15秒	靶分子长度最好在80～200bp
  	60℃ 60秒	在此步采集荧光信号，通道根据标记染料决定

  
  
• 数据处理
  如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
  如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于40，则为阴性。如果Ct小于40则为阳性。

• 不需要ROX的机型：Agilent MX3000和MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、，、Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System等型号的荧光PCR仪器不需要加ROX染料，但加入的话也不会影响整个PCR分析。
  
• 需要使用ROX I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step One Plus。
  
• 需要使用ROX II的机型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、Corbett RotorGene 3000。