人端粒绝对长度检测试剂盒(探针法qPCR)

产品货号：

KL230434

中文名称：

人端粒绝对长度检测试剂盒(探针法qPCR)

英文名称：

Human Absolute Telomere Length Assay(Probe qPCR)

产品规格：

50T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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简要说明：

本制品是以探针法荧光定量qPCR技术为基础开发的，用于专门检测人端粒长度的试剂盒。

背景资料：

端粒（Telomere）是指真核细胞染色体末端独特的蛋白质-DNA结构，人类端粒由TTAGGG重复串联构成，长度为5～15kb。端粒对于染色体的稳定非常重要，其主要通过防止染色体降解及端端融合来维护染色体的稳定和功能。细胞每次分裂端粒减少20～200bp，直到达到关键长度，此时细胞步入老化阶段。因此，外周血白细胞的端粒长度与年龄呈负相关，因此快速检测端粒长度具有重要的意义。

检测原理：

先测定出每个样本中的端粒拷贝数T和单拷贝内参基因的拷贝数S，然后计算出其比值T/S，通过比较该比值大小来计算两个比较样本中端粒的相对长度。

产品特点：

即开即用，用户只需要提供外周血DNA模板。
操作只需要半天，比Southern杂交检测法快3～5天时间。
端粒长度检测更加可靠。端粒与内参单管检测，减少孔间干扰。内参基因为多拷贝，与端粒量差降低。
端粒长度计算更加准确。引入已知端粒绝对长度的标准品和校正品，一个用于构建标准曲线，一个用于校正，可同时获得样品的相对长度（T/S）和绝对长度。

产品组成：

组分	规格	保存
DNA纯化液	250μL×2	4℃
DNA分选磁珠	750μL×2	4℃
标准品冻干粉	1管	-20℃
校正品冻干粉	1管
qPCR Master Mix	780μL
引物探针冻干粉	1管
石蜡油	500μL
RNase-Free Water	1mL

保存：按标签指示条件保存，有效期6个月。

用户自备：
样品DNA、无水乙醇、TE洗脱液。

注意事项：

为了您的安全和健康，请穿戴实验服、口罩，并戴手套操作；
本试剂盒提供试剂，使用前先低速离心后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，并低速短暂离心后使用。
磁珠悬液严禁冷冻、离心，第一次使用前需充分涡旋混匀；
进行DNA片段分选时，建议样本体积≥50μL，若样本体积不足50μL请用RNase-Free Water补足；
磁珠使用前须提前半小时取出，平衡至室温；
任何过程中严禁磁珠过分干燥，否则会降低洗脱效率；
80%乙醇需现用现配，否则将影响回收效率。
标准品、校正品的绝对长度，请咨询北京基因科技有限公司。产品批次不同，绝对长度会有差异。
样品及标准品浓度过高或过低会影响扩增效率，对实验造成干扰，测量结果误差较大。

使用方法：
一、DNA纯化步骤：DNA前处理

标准品和校正品先进行12000rpm离心5min，离心后小心开启，每管再分别用66μL RNase-Free Water复溶。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，并低速短暂离心后使用。
引物、探针干粉先12000rpm离心5min，再用517μL RNase-Free Water复溶，得到引物、探针混合液。
各试剂使用前请上下轻柔颠倒十次混匀，后低速离心、小心开启。避免起泡。
1μg DNA样本或20μL标准品/20μL校正品中加入10μL DNA纯化液并混匀，37℃金属浴30min，90℃金属浴2min。

二、DNA纯化步骤

将磁珠由2～8℃中取出，室温平衡至少30min。涡旋震荡或充分颠倒磁珠以保证混匀；
根据要求向含有样本的离心管内加入30μL磁珠悬液，涡旋混匀(或使用移液器小心吹打10次)；
室温静置5min；
室温12000rpm离心30 s（该步骤可以加速聚集磁珠，可选）；
将离心管置于磁力架上至溶液完全澄清（约1min），弃去上清；
保持离心管固定于磁力架上，加入200μL 80%乙醇，静置1min，无需重悬磁珠，弃去上清（保持离心管固定于磁力架上）；重复该操作一次；
保持离心管置于磁力架上，静置通风2～5min除醇；
除醇过程中请勿过分干燥磁珠，否则会降低纯化效率。
将离心管从磁力架上取下，加入30μL TE洗脱液洗脱，涡旋混匀(或使用移液器小心吹打10次)；
室温静置5min；
室温12000rpm，离心30 s（该步骤可以加速聚集磁珠，可选）；
将离心管置于磁力架上至溶液完全澄清（约1min），待磁珠完全吸附后将上清转移至新样品管中备用。

三、标准品和校正品准备

标准品质量的标化：标准品DNA和校正品DNA经DNA纯化液纯化后，用DNA分选磁珠进行分选，具体步骤见二。
校正品稀释：DNA磁珠分选后的校正品中的DNA标化为4ng/μL，体积为20μL。
标准品浓度稀释：DNA磁珠分选后的标准品中的DNA标化为8ng/μL，体积为40μL（标为管1），用RNase-Free Water进行2倍梯度稀释得到管2、管3。
从管1中吸取20μL，加入到管2中，另外加入20μL RNase-Free Water得到溶液2；在管3中加入20μL溶液2，另外加入20μL RNase-Free Water得到溶液3。连续的稀释方法得到标准曲线R2可达到0.99左右。

四、样品前处理

血液样本：血液样本建议在﹣20℃保存，本试剂盒支持从淋巴细胞中分选的白细胞或血液经红细胞裂解液处理分选的白细胞进行核酸抽提。
细胞样本：建议采用我司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒抽提DNA，用于后续端粒长度的检测。
唾液样本：唾液样本需要细胞分选再抽提DNA，分选操作较复杂，建议咨询本公司技术人员。

五、样本质量的标化

端粒长度的测定与样本质量相关性较大，DNA质量要求较高，需要对样本及标准品DNA纯化，保证样本的均一化。样本DNA经DNA纯化液处理（37℃金属浴30min，90℃金属浴2min）后，可根据样品的质量分别采用磁珠分选或割胶回收的方法。
磁珠分选方法：经DNA纯化液纯化后，如果样本DNA质量较好，采用磁珠分选方法。详细纯化DNA过程见步骤二。
割胶回收方法：经DNA纯化液纯化后，如果样本DNA质量较差，采用割胶回收方法。
具体操作：取1μg样本进行0.7～0.8%琼脂糖凝胶电泳后，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化DNA片段，回收效率10%～30%，和基因组DNA的完整程度有关。

六、样本浓度的标化：标准曲线法

经磁珠分选的样本DNA浓度标化至4ng/μL，上样5μL。标准品的DNA浓度标化至8ng/μL，按2倍和4倍梯度稀释后，上样5μL，用于构建标准曲线（3个梯度的25.DNA总上样量分别为40ng、20ng、10ng）。校正品的DNA浓度标化至4ng/μL，上样5μL，用于校正。连续的稀释方法得到标准曲线R2需达到0.99以上。
经割胶回收的样本、标准品和校正品浓度标化方法同上。
样品及标准品的浓度过高或过低会影响扩增效率，对实验造成干扰，测量结果误差较大。

七、SYBR qPCR反应（45μL体系，在样品制备室进行）

在反应管中按下表加入各成分（操作需全程在冰上进行）：

成分	样品管	校正品	标准曲线样品(1～3管)
qPCR Master Mix	各15.6μL	15.6μL	各15.6μL
引物、探针混合液	各9.4μL	9.4μL	各9.4μL
待测DNA样本	各5μL	不加	不加
第17步所得校正品稀释液	不加	5μL	不加
第18步所得标准曲线样品稀释液（1～3号）	不加	不加	各5μL

可以先将qPCR Master Mix、引物、探针混合液先混合，25μL分装。向已分装过qPCR Mix的反应管中加入15μL石蜡油。向反应管中穿过石蜡油层加入样品，短暂离心后进行qPCR。盖上八联管盖或者光学膜后盖上反应管盖子或者贴上光学膜，为避免影响荧光信号读取，请注意不要在管盖或者膜上做标记，或者用刮板反复摩擦。

盖上盖子后上机，按下面参数进行qPCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	2min
PCR反应（30个循环）	95℃	15sec.
	50℃	1min
	72℃	45sec.
50℃退火时收集荧光信号
通道选择：样本检测通道-SYBR Green（FAM）；内参检测通道-VIC

八、阈值设定

基线设置在2～7个循环。
阈值的设定要保证样本及标准品的3重复的△Ct在0.3以内。
阈值设定：内参和端粒扩增曲线阈值拉同一根线，都定为700；40ng标准品端粒的Ct值定为13±1，内参的Ct值定为18±1；标准品端粒和内参的△Ct为5±0.5。
阈值设置以后，标准品3个浓度梯度之间呈现较好的Ct差异，端粒通道和内参通道的△Ct均在0.8左右。
根据标准品标准曲线，若R2＜0.99，表明操作有误。

九、数据处理

标准曲线的构建：以标准品3个浓度梯度下的平均Ct值为横坐标（x），3个梯度的Log2浓度为纵坐标（y），构建标准曲线。
利用标准品标准曲线计算校正品的T/S：将校正品的端粒和内参通道的Ct值代入标准曲线方程x，即可得到y值，则各得相对上样量为2y，即可得校正品的T/S（端粒相对上样量/内参相对上样量）。
利用标准品标准曲线计算样本的T/S：将样本的端粒和内参通道的Ct值代入标准曲线方程，即可得到y值，则各得相对上样量为2y，即可得到样本的T/S（端粒相对上样量/内参相对上样量）。
校正系数的计算：已对标准品和校正品的端粒长度做TRF检测，绝对端粒长度已知（假定标准品的绝对长度为5430bp，校正品的绝对长度为5100bp），则qPCR法校正品测定端粒长度已知（如5430*校正品的T/S=校正品测定值），即可用于校正品的校正系数T/S的计算，为5100/校正品测定值=校正系数T/S。
样本端粒绝对长度的计算：
样本端粒绝对长度=样本T/S*校正系数T/S*标准品绝对长度（5430bp）

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