产品货号：
KL2304252
中文名称：
通用型MLPA试剂盒
英文名称：
General MLPA Kit
产品规格：
100T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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MLPA（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification，多重连接依赖性探针扩增）是一种基于连接反应的中度多重半定量PCR技术，主要用于检测基因拷贝数的变化。本制品就是在MLPA基础上进行改良后开发而得。
- 本制品为MLPA通用基础试剂，用户需要自备基因专一性探针及引物。
- 操作流程大幅优化，半天内即可完成。
- 最多可同时检测60个靶点的拷贝数变化。
- 起始材料为纯化好的基因组DNA、预先扩增得到的PCR或RT-PCR产物。本试剂盒不含DNA纯化相关试剂。
- 本制品足够100次基础50μL体系的MLPA检测。
- MLPA产物可以用于后续的毛细管电泳和分析，本试剂盒不含相关试剂。
- 本制品只能用于科研。
| 组分 | 规格 |
| MLPA杂交液 | 400μL |
| MLPA连接酶 | 100μL |
| MLPA连接缓冲液 | 300μL |
| MLPA PCR MasterMix | 1mL |
保存：-20℃，避光，有效期1年。
样品DNA，超纯水，TE0.1缓冲液（10mM EDTA，0.1mM EDTA），甲酰胺，MLPA PCR引物，MLPA探针，毛细管电泳仪及分析软件
一：制备MLPA探针混合液
- 自行设计探针。每个靶点需要一条左探针（LPO）和一条右探针（RPO）探针，其长度应该不短于21nt，GC含量最好为50%，ΔG不小于0，其与靶点结合区域的Tm大于68℃。探针不得有发夹结构，回文结构，彼此或自身不能形成引物二聚体。RPO的5端必须磷酸化。
- 合成的探针需要HPLC纯化。探针干粉用TE0.1缓冲液稀释到合适的浓度。每个探针的最终浓度（在MLPA反应体系中的浓度）需要自行优化，使得每套探针跟同一反应体系需要使用的其他几十套探针产品的信号强度一致。每套探针的最佳终浓度可能有所不同，但一般在100 pM左右。
- 如果这些探针需要在50重MLPA体系中共用，则配制成4*50 = 100×的母液。如果这些探针需要在40重MLPA体系中共用，则配制成4*40 = 800×的母液。以此类推。
- 将这些探针按等比例混合，得到20×探针混合液，按每次实验所需要的量分装，放-20℃待用。
- 实例：假设某套探针的最佳终浓度为100 pM，它将在50重MLPA体系中使用，则需要先配制成4*50*100 pM = 10 nM的母液。然后再跟其他49套探针等比例混合，得到每套探针浓度为10/50 = 0.2 nM的4×MLPA探针混合液。
- 自行设计和制备MLPA引物混合液。必须满足PCR引物的标准，HPLC纯化，先配制成20μM的母液，然后两条引物等比例混合，得到MLPA引物混合液，每条引物的浓度为10μM。根据每次使用量分装，-20℃保存。
二、制备DNA模板
- 按自备的方法制备基因组DNA，以基因组DNA为MLPA起始模板。也可以基因组DNA或RNA为模板先进行PCR或RT-PCR预扩增，纯化得到扩增产物，再以之为MLPA的起始模板。如果有N个样本，最好进行N+3个样本制备，多出的一个为PNC（Purification Negative Control，样本制备阴性对照），使用确定为阴性的样本为起始材料，另一个为PPC（Purification Positive Control，样本制备阳性对照），确定为阳性的样本为起始材料。
- 纯化得到的DNA样品最后需要溶解在自备的10mM Tris-HCl，pH为8.0的溶液中，浓度必须为2ng/μL。DNA样本不得抽干浓缩后使用，因为抽干或浓缩后盐离子浓度会增加，会抑制后续的连接反应。
三、MLPA反应
- 按下表根据反应数量制备MLPA连接MasterMix，放冰上待用：
成份 1个反应的量 N个反应的量 超纯水 28μL 28μL×（N+1） MLPA连接缓冲液 3μL 3μL×（N+1） MLPA连接酶 1μL 1μL×（N+1） - 计算反应数：如果有N+2个样本，则需要标记N+4个0.2mL PCR管或96孔板，N+2个用于N+2个DNA样本，多出的2个一个用于连接反应NTC（无模板对照），一个用于MLPA的NTC。然后按下表进行操作：
操作 N+2管 连接NTC PCR NTC 加入N+2个待测的DNA 各2μL 不加 不加 PPC DNA 不加 2μL 2μL 加4×MLPA探针混合液 各2μL 2μL 2μL MLPA杂交液 各4μL 4μL 4μL 变性和杂交 在PCR仪上95℃变性1分钟，然后70℃杂交20分钟 加MLPA连接MasterMix 32μL 32μL 32μL 连接和灭活酶 54℃连接15分钟，98℃ 5分钟灭活酶 加MLPA PCR Mix 9μL 9μL 9μL MLPA引物混合液 1μL 1μL 1μL PCR （95℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃60秒） 35次循环，
72℃ 20分钟，15℃保持
四、毛细管电泳及数据分析（本试剂盒不提供相关试剂）
- 采用毛细管电泳仪器进行毛细管电泳。建议使用：ABI-Prism 3100 (Avant) ABI-3130 (xL)，ABI-3500c (xL)，ABI-3730 (xL)，ABI-SeqStudio Flex等仪器。
- 使用毛细管电泳仪器厂家提供的方法对MLPA数据进行分析。由于自备的MLPA探针包含质控片段，故可由此判断实验是否成功。
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