产品货号：
KL230316
中文名称：
凋亡DNA定量试剂盒(LM-PCR法)
英文名称：
Apoptotic DNA SYBR LM-qPCR Kit
产品规格：
50T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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细胞凋亡显著特点之一是细胞染色体被一种内源性核酸内切酶降解，产生长度为180～200bp的整倍数的DNA片段，称之为凋亡DNA Ladder。由于只有凋亡细胞才产生凋亡DNA Ladder，因此检测凋亡DNA Ladder对筛选哪些药物或处理可以调控细胞凋亡具有重要的指导意义。但凋亡细胞一般只占总细胞的很少比例，故通过常规方法检测不是灵敏度低，就是步骤繁琐，为此本公司开发了基于Linker Mediated-PCR（LM-PCR）的凋亡DNA实时荧光定量试剂盒，
- 一站式，用户不需要单独优化实验条件。
- 用于实时定量检测总DNA中所含的凋亡DNA。
- 起始材料为总DNA，免去单独提取凋亡DNA步骤。同时比细胞材料保存更方便。
- 利用染料法荧光定量LM-PCR，整个过程只要两小时（不含DNA纯化）。
- 灵敏度比TUNEL/FACS、Annexin-V/FACS和caspase ELISA等常规方法更高，最低可以检测到pg级别的凋亡DNA（相当于不到100个凋亡细胞）。
- 可以进行定性分析，也可以进行绝对定量分析。
- 定量分析时可计算出平均每个细胞中有多少凋亡DNA，线性范围在3个数量级。
- 本制品可以根据客户需求升级为单细胞凋亡DNA检测。
| 组分 | 规格 |
| LM-PCR Linker干粉 | 50T |
| 连接反应液(待加linker) | 1mL |
| LM-PCR通用引物干粉 | 50T |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL |
| T4 DNA连接酶 | 50μL |
| 2×SYBR qPCR MasterMix | 0.5mL |
| 超纯水 | 1mL |
保存：-20℃，有效期1年。
首次使用时需要将连接反应液（待加linker）全部转移到LM-PCR Linker干粉管中，得到已加Linker的连接反应液。同时，需要加入55μL超纯水到LM-PCR通用引物干粉中，涡旋震荡混匀。一次实验没有用完的需要-20℃保存。
细胞总DNA纯化试剂盒、凋亡DNA纯化试剂盒、细胞凋亡诱导试剂。
一、制备待测样品的总DNA
- 制备N个样品的总DNA（含基因组DNA和凋亡DNA），需要在纯化前准确进行细胞计数。所需起始细胞数量需参考所用DNA纯化试剂手册。得到DNA后需测OD260以确定其浓度和产量。一个人体细胞含有6.64pg DNA，可以通过预期总DNA产量和实际DNA产量计算出总DNA的产率。最后用自备的TE缓冲液将所有待测样品的总DNA浓度稀释到5ng/μL，放冰上待用。也可以分装成N个小份放-20℃保存。本试剂盒不含相关试剂。
二、制备凋亡DNA标准曲线样品（定性检测可以跳过此步）
- 用可以诱导细胞凋亡的条件处理已知数量的培养细胞，诱导细胞凋亡，然后纯化凋亡DNA，并电泳确认得到凋亡DNA Ladder，并且没有基因组DNA残留。一个人体细胞含有6.64pg DNA，可以通过预期总DNA产量和实际凋亡DNA产量计算出凋亡DNA的产率。将凋亡DNA的浓度用TE缓冲液调到25ng/μL，此溶液将作为PCR反应时的阳性对照。本试剂盒不含上述实验相关试剂。
三、制备凋亡DNA标准曲线样品的4倍梯度稀释液（定性检测可以跳过此步）
- 标记6个离心管，分别为1～6。
- 用带芯枪头（下同）分别加入30μL荧光PCR专用模板稀释液。
- 在1号管中加入10μL凋亡DNA阳性对照，充分震荡1分钟，得1号稀释液。
- 换枪头，在2号管中加入10μL 1号稀释液，充分震荡1分钟，得2号稀释液。
- 重复上面的操作直到得到6个稀释液，全部放冰上待用。
四、Linker连接反应
- 如果做定性分析：标记N+2个PCR管，其中N个用于第一步得到的N个待测样品，1个用于阴性对照，1个用于阳性对照。如果做重复，则按比例增加样品的反应管数量。各成分加样量如下：
成分 样品管N个 阴性对照 阳性对照 连接反应液(含Linker) 各19μL 19μL 各19μL N+2个待测样本(5ng/μL) 各20μL 不加 不加 第1步所得凋亡DNA标准曲线样品(25ng/μL) 不加 不加 4μL 超纯水 不加 20μL 17μL T4 DNA连接酶 各1μL 1μL 各1μL - 如果做定量分析：标记N+7个PCR管，其中N个用于待测样品，1个用于阴性对照，6个用于标准曲线。如果做重复，则按比例增加样品的反应管数量。各成分加样量如下：
成分 样品管N个 阴性对照 6个标准曲线管 连接反应液(含Linker) 各19μL 19μL 各19μL N+2个待测样本(5ng/μL) 各20μL 不加 不加 第7步所得6管凋亡DNA稀释液 不加 不加 各20μL 超纯水 不加 20μL 不加 T4 DNA连接酶 各1μL 1μL 各1μL - 总体积为40μL体系，16℃过夜保温16小时。
- 加360μL超纯水，将连接产物稀释10倍。
五、PCR反应
- 在0.2mL离心管中设置N+2个（对定性实验）或N+7个（对定量实验）PCR体系。在每管中分别加入的成分：
成分 用量 连接液产物的10倍稀释液 9μL LM-PCR通用引物 1μL 2×SYBR qPCR MasterMix 10μL - 离心数秒，按下列参数进行PCR扩增：预合成72℃ 4分钟（不是94℃变性），然后PCR循环40次（94℃1分钟，72℃43分钟，采集SYBR通道的荧光信号）。由于凋亡DNA片段长短不一，故不能设置溶解曲线分析。
六、数据分析
- 判断实验有效性：
如果阴性对照出现阳性结果（有倒S型荧光信号，Ct在35以下），则整个实验结果无效。可能是污染或其他原因，需要找到原因后才能继续。
如果阳性对照出现阴性结果，则整个实验结果也无效，需要找到原因后才能继续。
如果阳性结果为阳性，阴性结果为阴性，则实验有效，可以继续分析。 - 如果是定性检测，只判断待测样本阳性或阴性。如果其Ct没有读数、大于或等于40则均判为阴性，如果小于40则为阳性。
- 如果是定量检测，则以标准曲线样本的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品凋亡DNA的浓度的log值，再推算出其浓度。再根据凋亡DNA的产率，推算出纯化出这些凋亡DNA需要多少细胞，最后得出每个细胞有多少凋亡DNA。
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