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eccDNA就是extrachromosomal circular DNA（染色体外环状DNA）的简称，它们是从正常基因组中分离或脱落下来，游离于染色体基因组之外的环状DNA。长度主要分布在0.1～5kb之间，99%小于25kb。近年来研究表明，eccDNA普遍存在于包括酵母在内得真核细胞中，因此其进行深入研究具有重要的意义。但是纯化eccDNA，尤其是测序级的eccDNA一直是个难题，为此本公司开发了本试剂盒。

• 即开即用，直接用培养的酵母细胞为起始材料，最后得到纯化的eccDNA，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。
  
• 基于沉淀法，不用过柱法和磁珠法，减少短的eccDNA的丢失。
  
• 含专门的酶切消化线状DNA的步骤，降低线状DNA的干扰。
  
• 本制品含荧光染料法滚环扩增试剂盒，进一步富集eccDNA。
  
• 本制品一次可以处理约5×10⁸个培养的酵母细胞。
  
• 本制品足够25次eccDNA的纯化和扩增实验。

• 培养酵母细胞：按常规方法离心沉淀5×10⁶个酵母细胞。
  
• 加入10mL酵母eccDNA提取溶液A后重悬细胞，加入玻璃珠（800nm）0.1g，涡旋震荡3分钟。
  
• 加入10mL酵母eccDNA提取溶液B，轻柔颠倒10次。
  
• 加入10mL酵母eccDNA提取溶液C，轻柔颠倒10次。
  
• 常温离心7500g 10分钟，此步将沉淀下大部分染色体DNA和蛋白质。
  
• 将上清液体转移到新的10mL离心管中。
  
• 加入等体积的酵母eccDNA提取溶液D，涡旋震荡3分钟。
  
• 常温离心7500g 5分钟，蛋白质将在两相中间形成白膜。小心将含DNA的上清转移到新的离心管中。
  
• 重复第11～12步一次。
  
• 常温离心7500g 5分钟，残留蛋白质将在两相中间形成白膜。小心将含DNA的上清转移到新的离心管中。
  
• 加入2倍体积的酵母eccDNA提取溶液E，颠倒混匀后，常温离心7500g 10分钟。
  
• 加入自备的10mL 75%乙醇，颠倒混匀后，常温离心7500g 3分钟。
  
• 吸弃上清后，再短暂离心，再吸弃上清。沉淀即含有酵母eccDNA的粗提物。
  
• 开盖短暂放置在室温3分钟。
  
• 加入50μL 1×线状DNA消化缓冲液，再加入1μL线状DNA消化酶，轻柔吹打混匀。
  
• 37C保温2小时。
  
• 加入酵母eccDNA提取溶液D，充分涡旋震荡混匀。
  
• 常温离心7500g 5分钟，将上清液转移到新的离心管中。
  
• 加入2倍体积的酵母eccDNA提取溶液E，颠倒混匀。
  
• 常温离心4500g 10分钟。
  
• 加入10mL 75%乙醇，颠倒混匀后，常温离心4500g 3分钟。
  
• 吸弃上清，短暂离心，再吸弃上清。
  
• 加入20μL超纯水，吹打溶解酵母eccDNA沉淀。由于有助沉剂，所以沉淀可见。
  
• 取5μL进行RCA扩增，剩余的放-20℃长期保存。
  
• RCA扩增：在两个PCR管中，分别加入加入5μL eccDNA模板（样品管）和5μL超纯水（阴性对照管），再分别加10μL 2×RCA扩增液，2μL 20×随机引物V2.0，2μL超纯水，共19μL。95℃ 5分钟变性，立即放冰上，再分别加入1μL的phi39 DNA聚合酶，30℃保温16小时。如果使用荧光定量PCR仪保温，则设置每10分钟一个循环，温度30℃，每次循环采集一次SYBR通道的荧光信号。样本管应该有标准的扩增曲线，而阴性对照管将没有扩增曲线。
  
• 70℃ 10分钟变性灭活酶，所得扩增后的DNA可以用于各种后续实验。