产品货号：
KL230222
中文名称：
eccDNA纯化及扩增试剂盒
英文名称：
eccDNA Purification and Amplification Kit
产品规格：
25T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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eccDNA就是extrachromosomal circular DNA（染色体外环状DNA）的简称，它们是从正常基因组中分离或脱落下来，游离于染色体基因组之外的环状DNA，含量非常低，长度主要分布在0.1～5kb之间，99%小于25kb。近年来研究表明，eccDNA往往在肿瘤和衰老过程中富集，以特殊的方式参与肿瘤和衰老的发生发展进程。在大部分人类癌症细胞中eccDNA广泛存在，且它的富集通常会促进癌基因的扩增，从而增加了癌基因的可塑性和不稳定性，因此其对肿瘤细胞的进化可能存在重要的意义。但是纯化eccDNA，尤其是纯化测序级的eccDNA一直是个难题，为此本公司精心开发出了包埋法eccDNA纯化技术。
- 即开即用，起始材料最好为贴壁或悬浮培养细胞、实体组织、白细胞。如果是实体组织或冷冻组织，效果稍差。
- 采用包埋法纯化，极大程度抑制了细胞核DNA的污染。
- 采用沉淀法纯化，避免采用磁珠和过柱纯化，防止了短eccDNA的丢失。
- 采用酶切去除人线粒体DNA，降低其对eccDNA分析的干扰。
- 采用荧光染料法滚环扩增RCA试剂盒，进一步富集eccDNA。
- 使用非生物源性的核酸助沉剂，避免了外源核酸对RCA和测序的干扰。
| 包装 | 组分 | 规格 |
| 包装一 | 包埋法eccDNA纯化溶液A | 75mL |
| 包埋法eccDNA纯化溶液B | 5mL | |
| 包埋液 | 25mL | |
| 去蛋白溶液A | 17.5mL | |
| 去蛋白溶液B | 7.5mL | |
| 微量核酸沉淀剂 | 35mL | |
| 包装二 | 蛋白酶K溶液(10mg/mL) | 500μL |
| 10×人mtDNA内切酶缓冲液 | 0.5mL | |
| 人mtDNA内切酶 | 25μL | |
| RCA专用随机引物干粉 | 25T | |
| Phi29 DNA聚合酶(10U/μL) | 13μL | |
| 10×Phi29 DNA聚合酶缓冲液 | 25μL | |
| dNTP-染料混合液 | 37.5μL |
保存：包装一置于室温，包装二置于-20℃，有效期一年。
本试剂盒提供的试剂足够满足25次eccDNA纯化和扩增实验，一次纯化可以处理2×107个细胞。
自备PBS、琼脂糖、75%乙醇。
整个过程所需溶液和设备（Dounce玻璃匀浆器）均需提前半小时将其放冰上预冷，下面的步骤所述溶液均是预冷液。
一、培养细胞的预处理
- 用自备PBS洗涤生长中的培养细胞3次。
- 用无菌的塑料刮片将细胞收集至一个小体积PBS内，用细胞计数器计算细胞数，再加入适量包埋法eccDNA纯化溶液A（以下简称溶液A）使细胞终浓度为2×107个细胞/mL。
二、新鲜组织样品的预处理
- 在干净的容器内（如培养皿），用干净刀片将新鲜组织切割成芝麻大小的小粒(1～2mm3)，放入装有PBS的Dounce玻璃匀浆器中匀浆。此步将使得细胞脱落，但也有很多细胞被机械裂解。
- 经两层纱布过滤除去结缔组织块。
- 用PBS洗悬浮涤细胞3次，用少量溶液A重悬细胞，用细胞计数器计算细胞数，再加入适量溶液A使细胞终浓度为2×107个细胞/mL。
三、冰冻组织样品
- 用-70℃预冷的研钵将冰冻组织研成粉末，然后混悬在PBS中。
- 经两层纱布过滤除去结缔组织连块。
- 用PBS洗涤悬浮细胞三次，用少量溶液A重悬细胞，用细胞计数器计算细胞数，再加入适量溶液A使细胞终浓度为2×107个细胞/mL。
四、血液白细胞样品的制备
- 用自选方法从全血中粗分出白细胞。
- 再用自备的红细胞裂解液将白细胞层中残留的红细胞裂解。
- 将白细胞重悬在PBS中，细胞终浓度为2×107个细胞/mL。
五、包埋块及包埋提取液的制备
- 在配制琼脂糖电泳胶所用的制胶托盘上，按常规方法以超纯水为缓冲液灌制2%琼脂糖凝胶，厚度为0.5cm左右，待其凝固后，用刀片将还在制胶托盘中的琼脂糖凝胶切出10个0.5cm×0.5cm大小的孔，挑出其中的胶块。将这个制胶托盘和上面的带10个小孔的凝胶放42℃金属浴上待用。
- 用水浴加热试剂盒提供的包埋液，80℃水浴融化后摇匀，取1mL到一新的离心管中，放42℃金属浴孔中待用。
- 将1mL细胞悬液（2×107个细胞/mL）加热到42℃。
- 在琼脂糖胶上掏空的每个孔中分别加入0.1mL包埋液，然后加入0.1mL细胞悬液，用枪头轻柔搅动让细胞和包埋液充分混匀。重复此操作，直到10个孔中都装满包埋液和细胞悬液的混合液。
- 将制胶托盘（包括托盘里的凝胶）在4℃放30分钟，10个孔中的包埋液-细胞混合液将凝结成包埋块。
- 用刀片切掉包埋块周边的琼脂糖凝胶，小心将10个包埋块分别转移到1个5～10mL的塑料离心管中。
- 分别加入2mL新鲜制备的包埋块eccDNA提取液。
- 制备2mL裂解液的方法：溶液A 2mL，溶液B 200μL，蛋白酶K溶液20μL，混匀后即可。
- 用脱色摇床在50℃轻柔摇晃12小时后用移液枪小心收集包埋块外的eccDNA提取液，共约2mL，平均分到4个1.5mL塑料管中，命名为eccDNA初提液。
六、eccDNA初提液去蛋白
- 由于eccDNA初提液中有高浓度的蛋白酶，因此需予以去除，否则会严重干扰后续实验。故在4管初提液中，分别加入0.5mL去蛋白溶液A，再涡旋震荡2分钟。
- 再加入0.2mL去蛋白溶液B，再涡旋震荡2分钟。
- 常温13000g离心5分钟，溶液将呈两层相。将含有DNA的上层转移到一个新的离心管中。
- 在上清中加入1mL的微量核酸沉淀剂（取用前需要颠倒混匀后取用），颠倒混匀，常温15000g离心15分钟，小心弃上清后加入1mL自备75%乙醇，颠倒10次，常温15000g离心3分钟，小心弃上清后短暂离心30秒。去掉残留的液体（约50μL）。
- 敞开盖子3分钟后，各加入50μL超纯水，吹打重悬，汇集在一起得eccDNA再提液200μL，用NanoDrop或PicoGreen法DNA定量试剂盒测试eccDNA再提液浓度。取20μL做eccDNA再提液留样作为后续实验的对照。
七、线粒体DNA酶切
- 本步只限人线粒体DNA。如果用生物信息学的手段排除线粒体DNA对测序数据的干扰，可以跳过此步。材料不是人细胞的也可以跳过此步。
- 在一个PCR管中设置如下反应：
成分 用量 10×人mtDNA酶切缓冲液 20μL eccDNA再提液 180μL 人mtDNA内切酶 1μL - 37℃保温4小时。
- 加入0.2mL去蛋白溶液A，再涡旋震荡2分钟。
- 再加入0.1mL去蛋白溶液B，再涡旋震荡2分钟。
- 常温15000g离心5分钟，溶液将呈两层相。将含有DNA的上层转移到一个新的离心管中。
- 在上清中加入0.4mL的微量核酸沉淀剂（取用前需要颠倒混匀后取用），颠倒混匀，常温15000g离心15分钟，小心弃上清后加入1mL自备75%乙醇，颠倒10次，常温15000g离心3分钟，小心弃上清后短暂离心30秒。去掉残留的液体后，开盖放置3分钟。
- 加入20μL超纯水，吹打溶解沉淀，得到去蛋白后的eccDNA精提液。用NanoDrop或PicoGreen法测试所得eccDNA的浓度。
八、去除人线粒体DNA效果检测
- 可以用自备的线粒体PCR试剂盒，以eccDNA再提液留样和eccDNA精提液为模板进行扩增，检测去除线粒体DNA的效果。本试剂盒不含人线粒体DNA检测试剂盒，用户需要另外购买。本步也可以跳过。
九、RCA扩增
- 按下表设置RCA反应。
- 一定要设置一个阴性对照NC。首次使用本制品时，需要在RCA专用随机引物干粉管中加入25μL超纯水，涡旋震荡溶解引物，再短暂离心10秒。没有用完的引物需要放置在-20℃保存。
成分 样本管 NC管 eccDNA精提液 5.5μL - 超纯水 - 5.5μL RCA专用随机引物溶液 1μL 1μL dNTP-染料混合液 1.5μL 1.5μL 10×phi29 DNA聚合酶缓冲液 1μL 1μL 合计 9.5μL 9.5μL - 95℃ 5分钟变性DNA，立即放冰上。
- 分别加入0.5μL的phi29 DNA聚合酶。
- 30℃保温16小时。如果使用荧光定量PCR仪保温，则设置每10分钟一个循环，每次循环采集一次SYBR通道的荧光信号。样本管应该有标准的扩增曲线，而阴性对照管将没有扩增曲线。如果阴性对照有扩增，则在出峰时需要停机，已经出峰的样本管的扩增产物可以使用。
- 70℃10分钟变性灭活酶，所得扩增后的DNA可以用于各种后续实验。
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