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本制品是根据T7体外转录技术研发的WTA试剂盒。扩增得到的单链RNA能直接用于各种后续试验，包括NGS、qRT-PCR、芯片表达分析、杂交反应等。

一个细胞所含的所有转录产物又叫转录组Transcriptome，对其进行二代测序是研究基因表达的最新方法，但是很多样品（FACS分离的细胞、FFPE切片或少量细胞样品）细胞数量有限，质量不高，并且还没法进行第二次取样，所以常常需要先进行全转录组扩增Whole Transcriptome Amplification。WTA的方法之一是T7转录法，它既可以得到反义aRNA（Antisense Amplified RNA），也可以再以反义aRNA为模板继续得到正义aRNA。

• 即开即用，用户不需要单独准备每个成分并进行优化。
  
• 只需要半天即可制备反义aRNA（相当于mRNA的互补RNA链），只要一天即可制备正义aRNA（相当于mRNA）。
  
• 以50ng mRNA为模板一般能制备10μg左右的、长度在200～1500bp之间的反义aRNA；以50ng aRNA为模板一般能制备40μg左右的、长度在200～1000bp之间的正义aRNA。
  
• 能保持RNA样品中各分子的相对丰度，Pearson相关性系数一般在0.9-0.95以上（跟起始模板用量、制备的是反义还是正义aRNA相关）。
  
• 体外转录时加入自备的标记UTP，可以制备标记的aRNA。

• 首次使用本试剂盒时需要在T7-Oligo-dT引物干粉管中加入20μL RNase-free水溶解引物得到0.1μg/μL，然后根据每次实验的用量再稀释部分到所需的浓度。T7-Oligo-dT引物所需量按每2ng RNA加1ng引物的比例加，如果模板RNA（含mRNA）是50ng，则加25ng引物。如果模板总RNA（含mRNA）是10ng，则加5ng引物。

• 按下表加入各成分：
  

  成分	用量
  自备的总RNA	1μL（500pg～50ng）
  T7-Oligo-dT溶液(X ng/μL)	1μL

• 65℃ 5分钟后室温放置2分钟，短暂离心后放4℃。
  

  成分	用量
  cDNA第一链合成反应液(含dNTP)	2μL
  MMLV逆转录酶(200U/μL)	1μL

• 轻柔吹打混匀后4℃ 2分钟，25℃ 30分钟，42℃ 60分钟逆转录，70℃ 15分钟灭活酶。
  
• 再加入下列成分：
  

  成分	用量
  RNase-free水	25μL
  5×cDNA二链合成缓冲液	8μL
  20×cDNA二链合成酶混合液	2μL

• 轻柔吹打混匀后，短暂离心，4℃保温1分钟，25℃保温10分钟，50℃保温30分钟，80℃灭活20分钟，最后4℃放置待用。所得为双链cDNA产物。
  
• 按下表加入各成分：
  

  成分	用量
  超纯水	38μL
  E．coli外切酶I(20U/μL)	2μL

• 总体积80μL，37℃ 60分钟。

• 在80μL样品中加入180μL微量核酸沉淀剂，颠倒混匀后室温15000g离心15分钟，小心去上清。
  
• 再加入1mL自备的75%乙醇，15000g离心3分钟，小心去上清。
  
• 短暂离心，小心去残留上清约50μL。
  
• 敞开盖子短暂放置3分钟，加入20μL RNase-free水溶解沉淀，然后定量，再用部分或全部cDNA溶液作为模板进行体外转录。

• 按下表设置50μL的体外转录反应，用户可以根据需要设置阴性对照：
  

  成分	用量
  cDNA模板	1～20μL
  2×T7转录预配液	25μL
  T7 RNA聚合酶-RI混合液	2.5μL
  RNase-free水	至50μL

• 42℃保温4小时。
  
  • 不要超过4小时，否则T7 RNA聚合酶将降解掉合成的RNA。

• 长度检测：取5μL T7扩增产物进行PAGE电泳检测。标准的反应结果是产生长度在200～1500bp之间的产物。
  
• PCR检测：如果产物将用于RT-PCR，则可以不经过纯化直接稀释后。
  
• 浓度和纯度检测：加入RNase-free DNase降解DNA模板，用过柱法或酚氯仿抽提-乙醇沉淀法纯化RNA，去除DNA、引物和dNTP，在OD260的波长下测样品光吸收。由于扩增产物是反义单链RNA，故1OD260=40μg/mL。所得DNA可以放-20℃长期放置。
  
• 正义aRNA制备：用纯化的反义aRNA为模板，用试剂盒进行扩增，得到的就是正义aRNA。