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本制品是在环状RACE基础增加滚环扩增（RCA）步骤而成。环状RACE克服了得到RNA两端的序列信息需要做两次RACE的缺点，一次得到两端的信息。本制品在cDNA环化后，PCR扩增前增加了一步滚环扩增，对环化的cDNA进行专一性扩增富集，极大提高了靶分子在后续PCR扩增中的成功率。

• 即开即用，客户只需要准备总RNA（或mRNA）和专一性引物，不需要单独准备其他试剂。
  
• 增加滚环扩增步骤，对环化cDNA进行扩增富集，一般能扩增上万倍。
  
• 一次实验可以同时获得mRNA两端的序列。
  
• 通过适配子进行cDNA自连，不但效率高，而且测序时知晓哪里是自连位点。
  
• 本制品足够10次环状RACE实验（10次双链cDNA合成反应，20次环化反应，40次RCA反应，100次PCR反应）。
  
• 起始材料为纯化后的mRNA，用户需要准备两套PCR引物。

1. 利用已知道序列的区域设计基因专一性引物两套，方向向外（跟常规PCR向反），其中在距离5’端10～30个碱基设计的基因专一性引物叫5yw2，其下游100多个碱基设计的另外一对引物叫5yw1，两者同向，均向外扩增。在距离3’端10～30个碱基设计的基因专一性引物叫3yw2，其下游100多个碱基设计的另外一对引物叫3yw1，两者同向，均向外扩增。Tm最好为58℃。引物合成后需加超纯水溶解，使其浓度为10μM，然后1：1混合后，放冰上待用。没有用完的放-20℃保存。5yw1和3yw1混合得第1轮PCR引物混合液，5yw2和3yw2混合得第2轮PCR引物混合液。其相对位置图如下：
   
   

2. 在一个PCR管中，加入以下组分：
   

   成分	用量
   自备样品mRNA或RNA	6μL（0.5～2μg）
   环状RACE溶液A	2μL
   环状RACE溶液B	1μL
   70℃ 2分钟后室温放置2分钟，短暂离心。
   加入环状RACE溶液C	1μL
   轻柔吹打混匀后42℃保温90分钟。
   超纯水	49μL
   环状RACE溶液D	16μL
   环状RACE溶液E	4μL
   共79μL。吹打混匀后，短暂离心，16℃保温2小时，加入环状RACE溶液F 1μL，总体系80μL，16℃保温5分钟，70℃保温5分钟。

3. 加入160μL微量核酸沉淀剂，颠倒10次混匀后，15000×g离心10分钟后小心弃上清。
   
4. 加入1mL自备的75%乙醇，颠倒10次混匀，15000×g离心3分钟后小心弃上清。
   
5. 再短暂离心10秒，小心吸弃残留上清（约50μL）。
   
6. 加入40μL超纯水溶解DNA沉淀，所得溶液即为待环化cDNA溶液。将此溶液分成两个管，每管20μL，一管标为环化样本，另一管标为非环化对照。

7. 在上述两管中（各含有20μL cDNA溶液）加入以下组分：
   

   成分	环化cDNA 样本管	非环化cDNA 对照管
   超纯水	68μL	70μL
   环状RACE溶液G	10μL	10μL
   环状RACE溶液H	2μL	不加

   
   
8. 16℃保温16小时，65℃10分钟，最后得环化cDNA样本原液和非环化cDNA样本原液。

9. 放荧光定量PCR仪器上，设置30℃保温16小时，每10分钟设置成一个循环，采集一次SYBR通道的荧光信号。不要在设置时间到达后结束反应，而是在环化cDNA样本管的荧光信号进入平台期后立即结束两个管的扩增反应。如果荧光信号一直没有达到平台期，则在设置的时间结束反应。
   
10. 立即65℃保温10分钟灭活酶。由于phi29 DNA聚合酶有很强的3-5外切酶活性，因此必须灭活此酶，否则它将逐渐降解已经合成的DNA。

11. 在3个PCR管中，分别加入以下组分：
    

    成分	1号 环化模板	2号 非环化样模板	3号 无模板
    超纯水	6μL	6μL	8μL
    第1轮PCR引物混合液	2μL	2μL	2μL
    上步所得环化cDNA 样本RCA反应液	2μL	-	-
    上步所得非环化cDNA 样本RCA反应液	-	2μL	-
    2×染料法qPCR MasterMix	10μL	10μL	10μL
    合计	20μL	20μL	20μL

    
    
12. 按下列条件进行qPCR（注：应根据自备引物的Tm值选择适当的退火温度，下面的参数仅仅供参考）。
    第1步：94℃ 5分，48～52℃ 2分，72℃ 4分，设置一次循环
    第2步：94℃ 40秒，52～60℃ 1分，72℃ 3分，设置40次循环，在复性步骤采集SYBR通道的荧光信号。
    
13. 如果SYBR荧光信号呈现倒S型，则在其刚达到平台时终止PCR，即使循环数还没到设置的40次循环。如果SYBR通道没有荧光信号或到40次循环时荧光信号还没有到达平台，则按设置的40次循环进行PCR，按时结束。
    
14. PCR结束后，电泳检测。如果有清晰的、RACE专一的扩增产物（只有1号管样本有，而2号和3号样本管没有的DNA条带），则直接胶回收此特异条带、克隆、选10个转化子进行质粒测序。如果有多条清晰的、RACE专一的扩增产物条带，则优先选择分子量最大的条带。如果没有RACE专一的扩增产物条带，则再进入下步。

15. 在3个PCR管中设置如下反应：
    

    成分	4号管	5号管	6号管
    超纯水	6μL	6μL	6μL
    第2轮PCR引物混合液	2μL	2μL	2μL
    第一轮PCR 1号管反应液	2μL
    第一轮PCR 2号管反应液		2μL
    第一轮PCR 3号管反应液			2μL
    2×染料法qPCR MasterMix	10μL	10μL	10μL
    合计	20μL	20μL	20μL

    
    
16. 按下列参数进行PCR：94℃ 2分钟，（94℃ 30秒，50℃ 30秒，68℃ 2分）40个循环，在复性步骤采集SYBR通道的荧光信号。
    
17. 如果SYBR荧光信号呈现倒S型，则在其刚达到平台时终止PCR，即使循环数还没到设置的40次循环。如果SYBR通道没有荧光信号或到40次循环时还没有到达平台，则按设置的40次循环进行PCR，按时结束。
    
18. PCR结束后，电泳检测。如果有清晰的、RACE专一的扩增产物条带（只有4号管样本有，而5号和6号管样本没有的DNA条带），则直接胶回收此条带、克隆、选10个转化子进行质粒测序。如果有多条清晰的、RACE专一的扩增产物条带，则优先选择分子量最大的条带。如果没有任何RACE专一的扩增产物条带，则需要将第一轮PCR得到的3管PCR产物分别稀释10倍，100倍，1000倍后，再取2μL为模板进行第2轮PCR，共9个扩增。然后寻找RACE专一的扩增产物条带。
    
19. 得到专一条带克隆和测序结果后，再进入下一步。

20. 测序得到的结果同时包含了目标RNA的3端序列、逆转录引物序列和目标RNA的5端序列，故需要根据已知的逆转录引物序列和它们的相对位置关系，先将三者分开。它们的相对位置关系如下：
    
    
    
    
21. 上图逆转录引物互补序列（含polyA）左侧的区域到3yw1和3yw2结合位点之间的这段区域为目标RNA的3端序列。不排除逆转录引物跟RNA中间的富含A的区域结合，这样得到的序列不一定是RNA的3端，但这种情况只占少数。由于是对多个克隆进行测序，因此大多数序列还是目标RNA的3端序列。
    
22. 上图断裂处为环化位点，该位点右侧直到5yw1和5yw2之间的这段区域为目标RNA 5端的序列。
    
23. 将每个克隆得到的目标RNA 3端和5端序列跟目标RNA的已知序列（设计引物所使用的序列）、用户设计的4条RACE引物序列、RNA对应的基因组DNA序列（如果有的话）等一起进行多重比对，确定它们彼此的相对位置和同源序列。
    
24. 如果有必要，可以用得到的新的RNA序列再设计新的RACE引物，继续用本试剂盒克隆未知区域的序列。