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Oligo(dT)_12-18是由长度在12～18nt的Oligo(dT)混合而成，可以用在以poly(A) mRNA为模板进行的Oligo(dT) priming的逆转录反应。

首次使用本制品时，需要在Oligo(dT)_12-18引物干粉管中加入100μL超纯水，涡旋震荡半分钟混匀，得到0.5μg/μL的Oligo(dT)_12-18引物溶液，没有用完的引物需要放置在-20℃保存。

• 合成PCR用的第一链cDNA
  
  • 在一干净的反应管中加入RNA模板。
    

    RNA模板种类	用量
    总RNA	R100～500ng
    或poly(A) mRNA	R10～500ng
    或专一的RNA	R0.01pg～500ng

    • RNA模板不能含有基因组DNA污染。
  • 加入引物。
    

    引物种类	用量
    Oligo(dT)12-18,0.5μg/μL	1μL
    或随机引物（6碱基，无修饰）,0.2μg/μL	1μL
    或RNA模板专一性引物	15-20pmol

    • 随机引物与RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。
  • 加水至13μL。
    
  • 70℃保温5分钟后立即冰浴，此步可以打开RNA的二级结构。
    
  • 再加入5μL 4×RT Buffer（含dNTP）。
    
  • 37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA模板，可以改成45℃保温5分钟。但如果使用随机引物，由于其很短，则改成25℃ 5分钟以便其跟RNA结合。
    
  • 加入1μL MMLV逆转录酶（含RI），反应终体积为20μL。
    
  • 42℃保温60分钟。但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，待合成了一段cDNA后，然后再转移到42℃保温60分钟。此步为RT反应。
    
  • 70℃保温10分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，不需要纯化。
• 合成建文库用的第一链cDNA
  
  • 在一干净的反应管中加入RNA模板。

    RNA模板种类	用量
    poly(A) mRNA	1μg
    或专一的RNA	0.5～1μg

    • RNA模板不能含有基因组DNA污染。
  • 加入引物。
    

    引物种类	用量
    Oligo(dT)12-18，0.5μg/μL	1μL
    或随机引物（6碱基，无修饰），0.2μg/μL	1μL
    或RNA模板专一性引物	100pmol

    • 随机引物与RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。
  • 加水至13μL。
    
  • 70℃保温5分钟后立即冰浴，此步可以打开RNA的二级结构。
    
  • 再加入5μL 4×RT Buffer（含dNTP）。
    
  • 37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA模板，可以改成45℃保温5分钟。如果使用随机引物，则改成25℃保温5分钟。
    
  • 加入2μL MMLV逆转录酶（含RI），反应终体积为20μL。
    
  • 42℃保温60分钟，但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，然后再转移到42℃保温60分钟。此步为RT反应。
    
  • 70℃保温10分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的cDNA可以用于第二链cDNA的合成或放置在-20℃长期保存。