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本制品是一款专为一步法多重qRT-PCR检测开发的探针法预混液，适用于RNA病毒等多种RNA靶标的精准定量。产品采用无甘油配方并含有冻干保护剂，既可用于常规液体反应，也可直接兼容冻干工艺，便于制备成即用型冻干微球。内置高效dUTP-UDG系统，从源头降解残留PCR产物，彻底规避交叉污染风险，确保检测数据的准确性。搭载高活性DNA聚合酶与热稳定逆转录酶，配合优化缓冲液体系，针对血液、咽拭子等复杂模板实现高效特异性扩增。宽动态定量范围确保精准可靠的定量结果。本制品为包含无甘油的5×Mix、冻干保护剂及赋形剂，可直接用于冻干样品的制备，以提高样品的稳定性和易用性。

• 可冻干：可用于制作冻干粉或冻干小球。
  
• 超高灵敏度：检测下限可达单拷贝级别，精准捕捉微量靶标。
  
• 强抗干扰能力：优化缓冲体系能有效抑制复杂样本中的干扰，确保扩增效率。
  
• 防交叉污染设计：内置dUTP/UDG系统，可有效降解既往扩增产物的污染，从源头控制假阳性。

• 使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡；
  
• qPCR灵敏度高，建议将模板进行稀释使用，控制Ct值在20～35之间适宜；
  
• 本制品及冻干后样品使用若有剩余，请将本制品置于-20℃ ± 5℃储存，尽量避免反复冻融，影响产品使用；
  
• 本制品中已配备冻干辅料，若需增加其他冻干辅料，需根据实际检测数据评估后增加；
  
• 反应液的配制、分装请使用新的（无污染的）枪头、Microtube等，避免污染；
  
• 引物设计：推荐将扩增子长度设计在80～200bp范围内。较短的片段有助于提升扩增效率与检测灵敏度，并能有效减少复杂模板中的非特异性扩增。

• 用ROX I校准的Real-Time PCR仪有：
  ABI 5700/7000/7300/7700/7900/7900 HT/7900 HT Fast；ABI StepOne/StepOnePlus及其他仪器。
  
• 用ROX II校准的Real-Time PCR仪有：
  ABI 7500/7500 Fast；ABI ViiA7；ABI Q6；ABI Quant Studio 6/7 Flex；Stratagene MX4000/MX3005P/MX3000P及其他仪器。
  
• 不需要用ROX校准的RealTimePCR仪有：
  Bio-Rad CFX96/CFX 384/iCycler iQ5/iQ/My iQ5/MiniOpticon/Opticon/Opticon 2/Chromo4；Eppendorf Mastercycler ep realplex/realplex 2s；Cepheid SmartCycler；Illumina Eco qPCR；RocheApplied Science LightCycler 480；Thermo Scientific PikoReal Cycler；Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q/Rotor-Gene 3000/Rotor-Gene 6000及其他仪器。

• 冻干前样品检测：
  若需求在冻干前进行样品检测，可根据以下体系进行检测：
  

  成分	用量
  5×Multiplex Probe qRT-PCR Mix(UDG)	4μL
  4×Rehydration Buffer	5μL
  上游引物	0.2～1.0μM（终浓度）
  下游引物	0.2～1.0μM（终浓度）
  荧光探针（10μM）	0.4μL
  ROX	0.4μL
  模板	X μL
  RNase-Free Water	至20μL

  • 若需求只评测无甘油试剂性能，则可不添加4×Rehydration Buffer进行检测，其体积用RNase-Free Water补足即可。
• 若需求制备样品为冻干形式，则样品制备及使用建议如下：
  
  • 先根据需求配制反应体系，原位冻干/冻干微球配制体系如下：
    

    成分	用量
    5×Multiplex Probe qRT-PCR Mix(UDG)	4μL
    4×Rehydration Buffer	5μL
    上游引物	0.2～1.0μM（终浓度）
    下游引物	0.2～1.0μM（终浓度）
    荧光探针（10μM）	0.4μL
    ROX	0.4μL
    RNase-Free Water	至20μL

  • 将配制后原位冻干/冻干微球样品置于冻干机内进行冻干，具体冻干工艺可见推荐冻干工艺；
    
  • 待样品冻干后，将制备后的样品根据以下体系进行复溶。
    

    成分	用量
    原位冻干/冻干微球	1个
    ROX	0.4μL
    RNase-Free Water复溶	至(19.6-X)μL
    将以上配制完成的体系混匀后进行下一步。
    模板	X μL

• 推荐冻干工艺如下：
  

  步骤	温度 (℃)	斜率时间 (min)	持续时间 (min)	真空度 (Pa)	备注
  进仓	-45	/	120	/	需保证箱体温度下降至-45℃才可放入。 注：此步骤只针对冻干微球样品制备。
  预冻	-45	60①	180②	/	① 预冻斜率时间进行快速率降温； ② 持续时间根据包材、体积数量进行调整。 注：其中-25℃为冻干预冻过程中退火程序，若无需求可不进行。
  一次升华	-45	120③	720④	10	③ 斜率时间根据冻干机升降温速率及一次升华温度进行调整； ④ 持续时间根据包材、体积数量进行调整。
  解析干燥	0	120⑤	240⑥	10	⑤ 斜率时间根据冻干机升降温速率及一次升华温度进行调整； ⑥ 持续时间根据包材、体积数量进行调整。
  	10	120⑦	180⑧	0	⑦ 斜率时间根据冻干机升降温速率及一次升华温度进行调整； ⑧ 持续时间根据包材、体积数量进行调整。

  • 不同厂家或不同型号冻干机均会存在差异，请根据冻干机性能优化程序；
    
  • 若冻干机无斜率控制，请将升温过程分阶段进行；
    
  • 此推荐程序为1000T以内产品冻干程序，若冻干体积更大或数量更多，需对冻干程序调整；
    
  • 冻干后建议使用高纯氮气进行填充。
• 推荐qRT-PCR反应程序：
  

  •常规反应程序：	•快速反应程序：
  反应阶段 循环数 温度 时间 逆转录 1 50℃ 10min 预变性 1 95℃ 1min 变性 40～45 95℃ 10s 退火/延伸 60℃ 30s	反应阶段 循环数 温度 时间 逆转录 1 55℃ 2min 预变性 1 95℃ 30s 变性 40～45 95℃ 2s 退火/延伸 60℃ 15s