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本制品是一款专门用于植物样本直接扩增的PCR Mix，包含独特的裂解缓冲液，适用于植物组织直扩、植物品种鉴定（SSR）、植物转基因检测。本制品无需预先纯化DNA，仅需使用直径约1mm的植物组织（包括新鲜、冷藏或冷冻样本）经裂解缓冲液快速处理后，所得粗裂解液即可直接作为PCR模板。PCR Mix包含定向改造的DNA聚合酶，对植物源PCR抑制物具有较强的耐受性，兼容26%～82% GC含量片段扩增。为2×预混液形式，操作时仅需加入引物与模板，简单快速，提高了检测通量与结果重现性。PCR产物3'端“A”突出，可直接用于T/A克隆载体连接，适用于植物品种鉴定、转基因检测及其他分子标记辅助选择等。

• 耐受性强：对植物中的PCR抑制物具有较强的耐受性，适用常见植物叶片及种子直接扩增。
  
• 快速高效：1kb以内片段，延伸速度快至1s/kb；2kb以内5s/kb，4kb以内15s/kb。
  
• 兼容性强：GC含量26%～82%。
  
• 稳定性高：37℃放置14天，性能不变。

• 直扩PCR Mix和裂解缓冲液需完全溶解后使用，防止离子浓度不均匀。
  
• 应根据实验目的选择合适的循环数，循环数过少，会造成扩增量不足。循环数过多，扩增量增加，但突变率会增加，并造成非特异性扩增。
  
• 根据引物Tm值设置合适的退火温度，退火温度过低，会造成非特性扩增。退火温度过高，可能扩增不到目的条带。
  
• 对于植物粗品扩增或直扩，建议实验开始前以纯化的基因组DNA作为阳性对照，确保体系、引物及操作无误。
  
• 建议在所有直接PCR检测中使用无模板对照以监控污染。

• 样品处理：
  
  • 植物叶片：
    
    • 直接法：推荐使用幼嫩叶片（为了获得小且统一的样品，推荐使用固定直径0.5～3mm的打孔器打取样本），从植物上取一个0.35～5mm大小的圆片，并将圆片直接放入PCR反应液（50μL）中（确保叶片浸没在液体中）。对于长片段或使用直接方案的困难样品，较小的约0.35mm大小的样品可能会得到更稳健的结果。
      
    • 裂解法：推荐使用幼嫩叶片。从植物上取一个0.5mm～3mm大小的圆片，放入20μL植物裂解液中。用移液器吸头通过轻压管壁将叶片样品切碎。如果使用更大量的叶片组织（总量不超过1mg），则将稀释缓冲液体积增加到50μL。压碎叶片后，溶液应呈绿色。离心沉淀植物材料，将裂解液用水稀释5倍后取1μL上清液作为50μL PCR反应的模板。所需上清液体积可因所用植物材料和稀释体积而异。
  • 植物种子：
    
    • 直接法：使用干净的手术刀，去除种皮并切下一小块种子样品（直径0.5mm～3mm）。将样品直接放入PCR反应液（50μL体积）中（确保种子浸没在液体中）。建议使用去壳的种子。对于非常小的种子（如拟南芥），使用1-2粒完整种子直接放入PCR反应液中。
      
    • 裂解法：使用手术刀切下一小块去壳种子样品（直径0.5mm～3mm）并直接放入20μL稀释缓冲液中（确保种子样品被稀释缓冲液覆盖），用移液器吸头通过轻压管壁将样品切碎，并在室温下孵育3min。简短离心，将裂解液用水稀释5倍后取1μL上清液作为50μL PCR反应的模板。
• 常用反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  2×DirectPlant PCR MasterMix	25μL	1×
  上游引物（10μM）	2.5μL	0.5μM
  下游引物（10μM）	2.5μL	0.5μM
  模板	0.5～3mm植物组织/1μL植物组织裂解稀释液	-
  ddH2O	至50μL	-

  • 引物终浓度建议在0.2～1.0μM之间，特殊样本需探索引物投入量。
• 推荐PCR反应程序：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	94℃	5min	1
  变性	94℃	40sec	35
  退火	50～60℃	35sec
  延伸	72℃	1～15s/kb
  终延伸	72℃	10min	1

  • 大多数片段引物退火温度建议为60℃；也可以根据引物Tm值±3℃的温度作为退火温度；
    
  • 片段≤1kb，延伸速度1s/kb；片段≤2kb，延伸速度5s/kb；片段≤4kb，延伸速度15s/kb。

• 无产物或产量低
  
  • 如果使用您自己引物对纯化后DNA扩增无条带：
    
    • 优化退火温度。
      
    • 确保循环程序按推荐执行。
      
    • 检查引物设计。
  • 如果使用您自己引物对纯化后DNA扩增有条带，但直接扩增无产物：
    
    • 使用更小的样品（例如0.35mm打孔片）。
      
    • 增加循环数。
      
    • 对于大或困难样品及长DNA片段的扩增，使用A.3方案。
  • 如果使用您自己引物对纯化后DNA扩增有条带，但直接扩增无产物：
    
    • 将上清液用H2O稀释1:10或1:100，并在PCR中使用1μL作为模板。
      
    • 尝试压碎和不压碎样品两种方法。
      
    • 将样品在稀释缓冲液中室温孵育3min。
      
    • 使用更小的样品量或增加稀释缓冲液的体积。
• 非特异性产物-高分子量拖尾
  
  • 确保使用的延伸时间不过长；
    
  • 减少总循环数；
    
  • 提高退火温度或进行温度梯度PCR；
    
  • 降低引物浓度。
• 非特异性产物-低分子量离散条带
  
  • 提高退火温度或进行温度梯度PCR；
    
  • 缩短延伸时间；
    
  • 降低引物浓度；
    
  • 减少总循环数；
    
  • 设计新引物。