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本制品包含miRNA检测的全部试剂，适用于miRNA、Total RNA和small RNAs等包含miRNA样品的检测。以miRNA等样品为模板，用BalbScript miRNA RT Enzyme Mix、2×miRNA RT Reaction Mix高效加尾和合成第一链cDNA，miRNA检测使用2×miRNA SYBR qPCR SuperMix。

miRNA第一链cDNA合成试剂采用加A法和逆转录反应同步进行。本制品中的BalbScript miRNA RT Enzyme Mix包含了Poly(A) Polymerase和Reverse Transcriptase。2×miRNA RT Reaction Mix包含了miRNA加A尾反应和逆转录反应的所有原料，只需要加入miRNA模板和水即可进行反应，操作简单，降低实验过程中的污染。

2×miRNA SYBR qPCR SuperMix是采用SYBR Green I嵌合荧光法对miRNA进行荧光定量检测。试剂中预混了热启动DNA聚合酶、精心优化的反应Buffer、dNTPs、SYBR Green I等，进行实验时，PCR反应液的配制十分简单方便。提供两种ROX染料可校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，适用于不同型号的荧光定量PCR仪。另外试剂盒中提供Universal miRNA primer R检测引物，只需设计对应miRNA的上游引物即可，也可以根据说明书中提供的miRNA特异性引物设计原则来设计引物。

• 包含miRNA检测的全部试剂，逆转录和qPCR反应独立进行，每一步均经细致优化，大大提高miRNA检测效率；
  
• 逆转录试剂中将miRNA的加A尾反应和逆转录反应合二为一，无需复杂的实验操作；
  
• 通用加A尾法逆转录，可使用同一RNA模板进行不同miRNA的定量检测，节省样品用量；
  
• 简单的一步法cDNA合成系统和qPCR预混型试剂，减少操作步骤，节省反应时间。
  
• 本试剂盒可针对几乎所有样本提取的miRNA进行逆转录反应，Total RNA模板的使用范围可达10pg～5μg。

• 所有试剂使用前请上下颠倒混匀，尽量避免产生泡沫，并短暂离心后使用。
  
• 使用过程中应确保所用试剂中无RNase污染。
  
• 避免反复冻融。
  
• 反应液配制和添加应在冰上操作。
  
• 为保证逆转录反应的有效进行，需使用较高质量的RNA模板。

• 第一链cDNA合成
  
  • 试剂融化后，各组分混匀轻微离心后置于冰上。
    
  • 按顺序加入以下反应物：
    

    成分	用量
    模板	10pg～5μg(总RNA)
    2×miRNA RT Reaction Mix	10μL
    BalbScript miRNA RT Enzyme Mix	1μL
    RNase-Free Water	至20μL

  • 按以下条件进行逆转录反应：
    

    反应程序	说明
    39℃，60min	加A尾反应和cDNA合成
    85℃，5min	终止反应

  • 推荐Total RNA添加0.01～2μg，必要时可根据目的miRNA的丰度决定加入量，Total RNA最大投入量为5μg。
    
  • 如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，可先将RNA模板和RNase Free Water混匀后，65℃孵育5min，冰上冷却，然后再加入其它组分进行反应。
    
  • 反应产物可直接用于qPCR，如果不立即使用，-20℃保存。
    
  • 高浓度模板进行反转录，建议将获得的cDNA产物进行适度稀释（1～50倍）后用于后续的qPCR实验，以得到最适Ct值。
  
  
• 第一链cDNA的qPCR扩增
  该试剂盒包含10μM的Universal miRNA primer R，也可根据文后的miRNA特异性上、下游引物设计原则设计miRNA特异性引物。
  
  • 常用反应体系
    

    成分	用量
    2×miRNA SYBR qPCR SuperMix	10μL
    上游引物（10μM）	0.4μL
    下游引物（10μM）	0.4μL
    cDNA模板	XμL
    ROX（需根据机器型号选择添加）	0.4μL
    RNase-Free H2O	至20μL

  • 常用PCR程序
    
    • 两步法：
      

      温度	时间	循环数
      95℃	1min	1
      95℃	5 s	40～45
      60℃	30 s

    • 三步法：
      

      温度	时间	循环数
      95℃	1min	1
      95℃	5s	40～45
      60℃	20s
      72℃	30s

  • 该试剂盒提供Universal miRNA primer R，只需设计对应miRNA的上游引物即可。试剂盒中Universal miRNA primer R的Tm值为63℃，设计miRNA Primer F的Tm值也尽量在60～65℃范围之内。
    
  • 为了提高引物间特异性，也可以根据目的miRNA设计特异性上、下游引物进行检测（设计原则见下方）。
    
  • 引物设计完毕后，经过miRbase进行进一步验证（blast），以确定特异性。

• ROX I校准的Real Time PCR仪有：ABI 5700/7000/7300/7700/7900/7900 HT/7900 HT Fast;ABI StepOne/StepOnePlus及其他仪器；
  
• 用ROX II校准的Real Time PCR仪有：ABI 7500/7500 Fast;ABI ViiA7;ABI Q5 Q6;ABI Quant Studio 6/7 Flex;Stratagene MX4000/MX3500P/MX3000P及其他仪器；
  
• 不需要用ROX校准的Real Time PCR仪有：Bio-Rad CFX96/CFX 384/iCycler iQ5/iQ/My iQ5/MiniOpticon/Opticon/Opticon/Chromo4;Eppendorf MasterCyclerrealplex/realplex 2s;Cepheid SmartCycler;Illumina Eco qPCR;Roche Applied Science LightCycler 480;Thermo Scientific PikoReal Cycler;Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q/Rotor-Gene 3000/Rotor-Gene 6000及其他仪器。

• 对于正向引物：
  
  • 选择最长的正向引物（12～18个碱基长），需要在miRNA的3'末端留下4～8个碱基用于设计反向引物；
    
  • 设计正向引物，其3'末端的最后5个碱基中应包括2～3个A/T残基，最后的2个碱基中应包括1个A/T残基；
    
  • 当正向引物的Tm值低于60℃，需要在5'末端依次添加以下碱基：GACGC，需要单个碱基依次添加，查看Tm值的变化，直到Tm在60℃以上为止。
    例如添加三个碱基时，引物序列为：CAGN_12~18，其中N₁₈是18个miRNA特异性碱基，CAG是添加碱基；最长的引物则是：CGCAGN_12~18，其中N₁₈是18个miRNA特异性碱基，CGCAG是与miRNA不互补的5'末端序列；
    
  • 如果正向引物的Tm值较高（＞65℃），则一般需要从5'端移除碱基，直到Tm值小于65℃，大于60℃。
• 对于反向引物：
  
  • 根据正向引物设计原则步骤b选择最佳3'末端的反向引物。
    
  • 在反向引物的5'末端加入15个T碱基。
    
  • 反向引物的Tm值低于60℃时，需要在5'末端依次添加以下碱基：GACCTGGAC，需要单个依次碱基添加，查看Tm值的变化，直到Tm在60℃以上为止。
    例如添加三个碱基时，引物序列为：CAGT₁₅N_4~8，其中，N_4~8是8个miRNA特异性碱基，T₁₅是15个T碱基，CAG是添加碱基。最长的引物则是：CAGGTCCAGT₁₅N_4~8，其中，N_4~8是8个miRNA特异性碱基，T₁₅是15个T碱基，CAGGTCCAG是与miRNA不互补的5'末端序列。
• 实例：hsa-miR-21（序列：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUG）
  正向引物：5'-GCAGTAGCTTATCAGACTGAT-3'
  反向引物：5'-GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCAAC-3