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本制品是通过采用分子进化技术对普通Pfu酶进行改造而获得的新型Fast Pfu酶，是新一代的高保真DNA聚合酶。该酶解决了高保真PCR反应中Pfu酶扩增灵敏度低、延伸速度缓慢的难题，能够高效、快速扩增≤6kb片段目的基因片段（最长可达20kb），模板低至0.05ng，并且在DNA末端补平、全基因合成、引入突变等之中有着很好的应用。

用于要求保真度比较高的PCR反应，包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突变、全基因合成、DNA末端补平等，也用于复杂模板，高GC/AT模板的扩增。

• 高保真：保真度高于Pfu酶，为普通Taq酶的50倍。
  
• 快速高效：Fast Pfu扩增速度为普通Pfu酶的数倍，72℃保温30秒可延伸1kb以上。扩增长度可达20kb，能高效扩增≤6kb片段。
  
• 高灵敏：可从0.05ng人基因组DNA模板中扩增出1.2kb特定基因片段，扩增性能显著优于普通Pfu酶。
  
• 独特配方的5×Buffer：使PCR扩增反应更加稳定、灵敏、高效。

在74℃条件下，30分钟内催化10nmol dNTPs掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量为一个单位。

组分	250U	1250U	5000U
快速Pfu DNA聚合酶(5U/μL)	50μL	50μL×5	1mL
5×Fast Pfu Buffer with Mg2+	1mL×2	1mL×10	10mL×4

保存：-20℃


经多次柱纯化，SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一的目的条带，qPCR方法检测无大肠杆菌DNA残留，无核酸内、外切酶污染。


Fast Pfu DNA聚合酶产生的PCR产物为平末端，无3'端"A"突出，除使用一步定向克隆试剂盒外，其它PCR产物的克隆方案有：

• PCR前引物进行5'端加磷修饰或将PCR产物磷酸化处理后再直接克隆于平末端的载体中。
  
• 将产物3'末端加A后再与T载体连接。
  
• 由于Fast Pfu DNA聚合酶的校对活性可引起引物从3'端被部分降解。因此在设计引物时应适当增加引物的长度，理想的引物长度为20～30mers。另外为了减少由3'→5'外切酶活性引起的引物降解，尽量在冰上配制反应体系，并最后加入Fast Pfu DNA聚合酶。

图1．50μL扩增体系中，λDNA为模板，扩增1kb～20kb片段。
泳道M：λ/Hind III DNA Marker；
泳道1：1kb；泳道2：2kb；
泳道3：4kb；泳道4：6kb；
泳道5：8kb；泳道6：10kb；
泳道7：12kb；泳道8：20kb。

• 对高GC含量模板，建议将变性温度提高到98℃。
  
• 对于高GC模板，建议配套使用PCR增强剂III，或者添加终浓度为5%～8% DMSO。
  
• 5×Fast Pfu Buffer中的Mg²⁺终浓度为2mM。

• 常用反应体系(50μL)
  

  成分	用量
  5×Fast Pfu Buffer with Mg2+	10μL
  上游引物	0.2～1.0μM(终浓度)
  下游引物	0.2～1.0μM(终浓度)
  dNTPs(各10mM)	1μL
  模板	1～50ng(质粒)
  	10ng～1μg(基因组)
  快速Pfu DNA聚合酶	0.25μL(1.25U)
  ddH2O	至50μL

  
  
• 常用PCR循环
  

  温度	时间	循环数
  94℃	90s	1
  94℃	20s	30
  50～60℃	20s
  72℃	1kb/30s
  72℃	5min	1
  4℃	保温	1

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