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本试剂盒是以RNA为模板的一步法定量PCR试剂。用基因特异性引物，以荧光探针进行扩增检测。在同一反应体系中，完成从反转录到qPCR检测的全部反应。本制品采用特殊工艺制造的HotStart Taq DNA聚合酶，并结合特别设计的反应缓冲液，对复杂模板（RNA病毒、疫苗等）能进行有效扩增，特异性高，能够在更广的范围内进行准确定量。

• 特异性高、灵敏度好：采用特殊工艺制造的HotStart Taq DNA聚合酶进行PCR反应，具有更高扩增效率和扩增灵敏度。
  
• 抗逆性能良好：独特的反应缓冲体系，使其能适应各种复杂类型模板的扩增。
  
• 反转录和qPCR反应在一管内完成，不需要额外的开管和移液操作，降低污染风险，提高检测通量。

• 确保所用试剂中无RNA酶污染。
  
• 为保证反应有效进行，需使用高质量的RNA模板。

• 常用反应体系
  

  成分	用量
  5×Probe One-Step qRT-PCR SuperMix	4μL
  BalbScript RT Enzyme Mix	1μL
  上游引物	0.2～1.0μM终浓度)
  下游引物	0.2～1.0μM(终浓度)
  探针(10μM)	0.4μL
  ROX(根据需要添加)	0.4μL
  RNA模板	1pg～1μg
  RNase Free Water	至20μL

• 常用PCR循环
  两步法可获得高特异性，三步法可获得高扩增率，根据需要选择不同的扩增程序。
  
  • 两步法扩增程序
    

    温度	时间	循环数
    42℃	5min	1
    95℃	10s	1
    95℃	5s	40
    60℃	40s

  • 三步法PCR扩增程序
    

    温度	时间	循环数
    42℃	5min	1
    94℃	10s	1
    95℃	15s	40
    50～60℃	20s
    72℃	30s

• 无Ct值出现
  
  • 检测荧光信号的步骤有误：一般染料法采用72℃延伸时采集，探针法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
    
  • ROX使用错误或者加量有偏差：当ROX浓度太低或太高时，都会影响机器修正后显示的荧光值，Ct值会显示为unknown或空白，可以根据仪器的类型选择合适的ROX类型（I或II），并严格按照1：50的比例添加。
    
  • 引物或探针降解：可通过电泳检测其完整性。
    
  • 模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
    
  • 模板降解：避免杂质的引入及反复冻融，必要时可以重新制备模板。
• Ct值出现过晚(Ct>38)
  
  • 扩增效率低，反应条件不够优化：设计更好的引物或探针；适当降低退火温度；改为三步法扩增。
    
  • PCR各种反应成分降解或上样量不足：更换试剂或加大上样量，重复实验。
    
  • PCR产物太长：一般采用80bp～150bp的产物长度。
    
  • 热启动时间过短，酶活性中心没有完全暴露，活性发挥受到了影响：建议热启动时间不低于1分钟。
• 扩增曲线异常，如断裂或者锯齿状曲线？
  
  • ROX使用错误或者加量有偏差：ROX浓度太低或太高时，机器对荧光值进行修正后会产生断裂的曲线，可根据说明书进行调整。
    
  • 分析数据时通道选择不正确，如没有在PCR mix中加入ROX，但分析时在仪器设置中选择了ROX选项，应根据反应的具体操作情况选择合适的通道。
    
  • 模板的浓度太高/降解或荧光染料发生了降解：建议更换模板或mix。
    
  • 反应管内有气泡：混匀后离心，避免气泡的残留。
    
  • 程序设置时间不当：适当延长延伸时间（40～60秒），充分收集荧光信号。
• 标准曲线线性关系不佳
  
  • 加样存在误差，导致标准品不呈梯度：重新加样并重复实验。
    
  • 标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
    
  • 引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针。
    
  • 模板中存在抑制物，或模板浓度过高：更换模板或提高模板稀释倍数。
• 负对照有信号
  
  • 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
    
  • 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
    
  • 模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，可以稀释模板的浓度或者更换模板。
    
  • 反应体系污染：更换mix、水或者引物等，避免交叉污染。
• 溶解曲线不止一个主峰
  
  • 引物浓度过高或者设计不够优化：应降低引物浓度或者重新设计引物，避免产生引物二聚体。
    
  • 体系被污染：更换试剂后重复实验。
    
  • 反应条件不够优化，引起非特异性扩增：设计特异性更高的引物或探针；适当提高退火温度；改为三步法扩增。
• 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？
  判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性。如果扩增效率在90%～110%，都是特异性扩增，可以把数据用于分析。
  
• 溶解曲线中，Tm不出现在80℃左右是怎么回事？
  扩增片段100bp左右的，一般应该出现在80℃左右。如果低于此温度出现，可能是模板降解。
  
• 溶解程序可否不加？
  如果扩增效果好，特异性高，可以选择不加溶解程序（建议加上）。此外，不同的机型对应不同的溶解曲线设置程序，可根据机型进行相应的设置。
  
• 扩增反应体系5μL，扩增效率低，是什么原因？
  反应体系太小，各种因素的影响相对较大，比如引物浓度、模板浓度及金属离子等都会影响扩增效率。

• ROX I校准的Real Time PCR仪有：
  ABI 5700/7000/7300/7700/7900/7900 HT/7900 HT Fast;
  ABI StepOne/StepOnePlus及其他仪器。
  
• 用ROX II校准的Real Time PCR仪有：
  ABI 7500/7500 Fast；ABI ViiA7;
  ABI Q6;ABI Quant Studio 6/7 Flex;
  Stratagene MX4000/MX3500P/MX3000P及其他仪器。
  
• 不需要用ROX校准的Real Time PCR仪有：
  Bio-Rad CFX96/CFX 384/iCycler iQ5/iQ/My
  iQ5/MiniOpticon/Opticon/Opticon/Chromo4；
  Eppendorf MasterCyclerrealplex/realplex 2s。
  Cepheid SmartCycler；Illumina Eco qPCR；
  Roche Applied Science LightCycler 480；
  Thermo Scientific PikoReal Cycler；
  Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q/Rotor-Gene 3000/Rotor-Gene 6000及其他仪器。