产品货号:
JN0016
中文名称:
Pfu DNA聚合酶
英文名称:
Pfu DNA Polymerase
产品规格:
250U|1250U
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本制品为Pyrococcus furiosus中分离的pfu DNA聚合酶基因在大肠杆菌中进行表达后经多步纯化分离而得。Pfu DNA聚合酶具有3'→5'外切酶(校正)活性,当聚合反应发生碱基错配时,聚合酶的校正活性可将错配的碱基切除。Pfu DNA聚合酶为使用范围最广的高保真DNA聚合酶,其错误率仅为1.3×10-6,推荐Pfu DNA聚合酶用于需高保真的PCR反应。
用于要求保真度比较高的PCR反应,包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突变、全基因合成,DNA片段的补平等。
在74℃条件下,30分钟内催化10nmol dNTPs的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量为一个单位。
组分 | 250U | 1250U |
Pfu DNA聚合酶(5U/μL) | 50μL | 50μL×5 |
10×Pfu Buffer with Mg2+ | 1mL | 1mL×5 |
dNTPs (10mM each) | 200μL | 200μL×5 |
保存:-20℃
经多次柱纯化,SDS-PAGE检测纯度大于95%,qPCR方法检测无大肠杆菌DNA残留,无核酸内、外切酶污染。
- Pfu DNA聚合酶产生的PCR产物为平滑末端,无3'端"A"突出,其PCR产物的克隆有几种方案:
- PCR前引物进行5'端加磷修饰或将PCR产物磷酸化处理后再直接克隆于平末端的载体中;
- 将产物3'末端加A后再与T载体连接;
- 引物中引入15bp与载体同源序列,利用一步定向克隆试剂盒直接连接到目的载体。
- PCR前引物进行5'端加磷修饰或将PCR产物磷酸化处理后再直接克隆于平末端的载体中;
- 由于Pfu DNA聚合酶的校对活性可引起引物从3'端被部分降解。因此在设计引物时应适当增加引物的长度,理想的引物长度为20~30bp。另外为了减少由3'→5'外切酶活性引起的引物降解,尽量在冰上配制反应体系,并最后加入Pfu DNA聚合酶。
- 2mM Mg2+可以满足绝大多数PCR扩增,对于某些PCR,为了保证较好的扩增,可调节为2~4mM。
- 体系中加入推荐的酶量,可以满足大多数PCR扩增,对于某些PCR,为了得到较好的扩增,可适当增加酶量。
图1.50μL扩增体系中,以5ng λDNA为模板,对500bp~6.0kb片段的扩增结果。
泳道1:0.5kb;泳道2:1.0kb;
泳道3:2.0kb;泳道4:3.0kb;
泳道5:4.0kb;泳道6:6.0kb;
泳道M:1kb DNA Ladder。
- 常用反应体系(50μL):
注:Mg2+终浓度为1.5mM成分 用量 10×Pfu Buffer with Mg2+ 5μL 上游引物 0.2~1.0μM(终浓度) 下游引物 0.2~1.0μM(终浓度) dNTPs (10mM each) 1μL 模板 1~50ng(质粒)
10ng~1μg(基因组)Pfu DNA聚合酶(5U/μl) 0.25μL (1.25U) ddH2O 至50μL - 常用PCR反应程序:
- 当扩增片段<3K:
反应阶段 温度 时间 循环数 预变性 94℃ 90s 1 变性 94℃ 20s 30 退火 50~60℃ 20s 延伸 72℃ 1kb/60s 终延伸 72℃ 5min 1 保温 4℃ - 1 - 当扩增片段≥3K(推荐引物长度≥30bp):
反应阶段 温度 时间 循环数 预变性 94℃ 20s 1 变性 94℃ 5s 30 退火/延伸 68℃ 1kb/60s 终延伸 72℃ 5min 1 保温 4℃ - 1
- 当扩增片段<3K:
相关搜索:Pfu DNA聚合酶,DNA聚合酶,高保真,Pfu酶,Pfu聚合酶,Pfu DNA Polymerase