产品货号:
JN0011
中文名称:
M-MuLV反转录酶(RNase H-)
英文名称:
BalbScript Reverse Transcriptase(RNase H-)
产品规格:
10kU|50kU
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本制品是通过基因重组技术克隆表达的缺失突变型RNase H-的M-MuLV反转录酶。一般的野生型M-MuLV(Moloney Murine Leukemia Virus)具有以下几种活性:依赖于RNA的DNA聚合酶活性;依赖于DNA的DNA聚合酶活性;RNase H活性。由于RNase H能够催化降解DNA/RNA杂合体中的RNA,因此在cDNA第一条链的合成反应中可能会降解RNA/DNA杂合体中的模板RNA。本酶的RNase H活性缺失,延伸能力强,可用于较长的cDNA合成,高比例的全长cDNA文库的构建以及Real Time RT-PCR反应等。
- 1st Strand cDNA的合成;
- cDNA Probe的制备;
- RT-PCR反应以及Real Time RT-PCR反应。
组分 | 规格 |
BalbScript M-MuLV反转录酶(RNase H-,200U/μL) | 50μL |
5×BalbScript RT Buffer | 1mL |
保存:-20℃。
经多次柱纯化,SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一目的条带,PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留,无核酸内、外切酶污染,无RNA酶污染。
以Poly(rA)·Oligo(dT)为模板/引物,在37℃、10分钟条件下,掺入1nmol的[3H] dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位。
- 用DEPC处理实验用到的所有实验器材,或者购买已经证明无核酸酶的实验用具,实验过程戴手套并经常更换手套,避免RNA酶的污染。
- 确保所用试剂及超纯水中无RNA酶污染。
- 纯化过的RNA必须保证不含有盐,金属离子,乙醇和苯酚,以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。
- 为保证反转录反应的有效进行,需使用高质量的RNA模板。
操作方法:
一、cDNA第一链合成反应体系
试剂融化后,将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。
- 按顺序加入以下反应物:
成分 用量 模板RNA 总RNA(0.1ng~5μg) poly(A) mRNA(10pg) 特异性RNA(0.01pg) 引物 Oligo (dT)18 1μL Random N6 1μL 基因特异性引物15~20pmol 5×BalbScript RT Buffer 4μL RNase Inhibitor(40U/μL) 1μL dNTPs(10mM) 2μL BalbScript M-MuLV反转录酶(200U/μL) 1μL RNase-Free Water 至20μL - 如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构,可先将RNA模板和RNase Free Water混匀后,65℃孵育5分钟,冰上冷却,再加入其它组分。
- 轻轻混匀,离心。42℃孵育15~30分钟。如果RNA模板中不含polyA结构,25℃先孵育5分钟,随后42℃孵育15~30分钟。
反应产物可直接用于PCR,如果不立即使用,-20℃保存少于一周,长时间保存建议-70℃放置。- 有实验结果提示,本反转录酶可在15分钟内完成1kb反转录反应。
二、第一链cDNA的PCR扩增
合成的第一链cDNA可直接用于PCR。
- 常用反应体系(50μL):
注:Mg2+终浓度为2mM成分 用量 2×Taq Master Mix 25μL 上游引物 0.2~1.0μM(终浓度) 下游引物 0.2~1.0μM(终浓度) 模板 1~2μL ddH2O 至50μL - 常用PCR循环:
温度 时间 循环数 94℃ 90sec 1 94℃ 20sec 30 57℃ 20sec 72℃ 1kb/60秒 72℃ 5min 1 4℃ 保温 1
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