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本试剂盒是基于M-MuLV反转录酶和热启动Taq DNA聚合酶，具有高效合成能力和高扩增效率。该试剂盒能以动物、植物和微生物的总RNA或mRNA为模板，用第一链cDNA合成预混液进行反转录，然后用2×HotStart Taq PCR MasterMix进行扩增。本试剂盒含有从RNA到cDNA，以cDNA为模板进行扩增的全部试剂。

• 操作简单：操作步骤少，降低污染。
  
• 特异性高：使用HotStart Taq酶进行扩增，减少非特异性反应。

• 本试剂盒进行PCR扩增时延伸时间为1kb/min，客户可根据具体片段长度进行延伸时间的调整。
  
• 如果同时操作多个样品，建议先在冰上先配制预混液，然后再分装到各个反应管中，加入模板启动反应。
  
• 反应扩增时出现目标条带拖带，系模板浓度过高或特异引物浓度不适等原因所致，可对模板及引物浓度等进行调整；反应出现杂带，可对退火温度进行调整，或重新设计特异性高的引物。
  
• 为了保证反应的正常进行，需使用高质量的RNA模板。

• 第一链cDNA合成
  试剂融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。
  
  • 按顺序加入以下反应物：
    

    成分	用量
    模板RNA	总RNA(0.1ng～5μg) poly(A) mRNA(10pg) 特异性RNA(0.01pg)
    2×BalbScript 1st cDNA SuperMix	10μL
    RNase Free Water	至20μL

    可选步骤：如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，可先将RNA模板和RNase Free Water混匀后，65℃孵育5分钟（有助于打开高级结构，便于下一步反应的进行），迅速置于冰上冷却，再加入其它组分。
    
  • 轻轻混匀，离心。
    
  • 42℃孵育15～30分钟（如果RNA模板中不含poly A结构，25℃先孵育5分钟，随后42℃孵育15～30分钟）。
    
  • 产物可直接用于下一步反应。如果不立即使用，可于-20℃保存一周，长时间保存建议-70℃放置。
• 第一链cDNA的PCR扩增
  合成的第一链cDNA可直接用于PCR。
  
  • 常用反应体系（20μL）：
    

    成分	用量
    2×HotStart Taq Master Mix	10μL
    上游引物	0.2～1.0μM（终浓度）
    下游引物	0.2～1.0μM（终浓度）
    模板	1～2μL
    ddH2O	至20μL

  • 常用PCR循环：
    
    • 当扩增片段＜3K：
      

      温度	时间	循环数
      94℃	5分钟	1
      94℃	20秒	30
      50～60℃	20秒
      72℃	60秒/kb
      72℃	5分钟	1
      4℃	保温	1

    • 当扩增片段≥3K（推荐引物长度≥30bp）：
      

      温度	时间	循环数
      94℃	5分钟	1
      94℃	5秒	30
      68℃	60秒/kb
      72℃	5分钟	1
      4℃	保温	1