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2×热启动PCR预混液(含蓝染料)是一种即用型的混合试剂，含有热启动Taq DNA聚合酶、MgCl₂、dNTP Mix、PCR添加剂、上样缓冲液和蓝色染料溴酚蓝。它是一种2×的混合试剂，含有除引物和模板以外的所有组分，用于PCR中DNA的扩增和检测。2×热启动PCR预混液(含蓝染料)含有PCR添加剂的缓冲系统减少了引物二聚体的形成，提高了扩增特异性和效率。简而言之，单一目的条带可以通过2×热启动PCR预混液(含蓝染料)获得。2×热启动PCR预混液(含蓝染料)含有DNA上样缓冲液，可直接进行琼脂糖凝胶电泳。

• 配制反应体系：将各组分分别溶解并混匀后短暂离心，根据下表准备反应体系。
  

  成分	50μL反应体系	终浓度
  2×热启动PCR预混液(含蓝染料)	25μL	1×
  正向引物(10μM)	1.0μL	200nM
  反向引物(10μM)	1.0μL	200nM
  模板DNA	1～2μL	-
  无菌双蒸水	至50μL	N/A

  每50μL反应体系最多使用30～100ng的基因组DNA或5～10ng的质粒。
• PCR反应程序：
  

  步骤	温度	持续时间	循环数
  预变性	95℃	3min	1
  变性	95℃	15s	30
  退火	最佳退火温度	15s
  延伸	72℃	10s
  终延伸	72℃	5min	1

• 目的条带没有或者很少
  
  • 不正确操作
    
    • 2×热启动PCR预混液(含蓝染料)中含有热启动DNA聚合酶，因此避免反复冻融。
  • 无目的扩增产物
    
    • 始终使用纯化、完整的高质量DNA作为模板。用琼脂糖凝胶电泳分析模板的完整性。
      
    • 确保引物可用。
      
    • 循环程序中缺少必要步骤，请检查循环程序。
  • 引物浓度过低
    
    • 使用引物终浓度为0.1～0.2μM。
• 目的条带以外出现非特异性条带
  
  • 引物很差
    
    • 重新设计引物，再检查一遍。
  • 引物二聚体的形成
    
    • 引物退火温度不是最优。
      
    • 重新查看引物并检查其特异性。